Électro

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 3286 (2022) Citer cet article

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Pour faire progresser notre compréhension des circuits neuronaux, il est essentiel de développer des interfaces multimodales peu invasives capables d'enregistrer et de moduler simultanément l'activité neuronale. Des dispositifs récents se sont concentrés sur la correspondance de la conformité mécanique des tissus pour réduire les réponses inflammatoires. Cependant, des réductions de la taille des interfaces multimodales sont nécessaires pour améliorer encore la biocompatibilité et les capacités d'enregistrement à long terme. Ici, une conception de microsonde coaxiale multimodale avec une empreinte peu invasive (diamètre de 8 à 14 µm sur des longueurs millimétriques) qui permet une interrogation électrique et optique efficace des réseaux de neurones est présentée. Dans le cerveau, les sondes ont permis une mesure électrique robuste et une stimulation optogénétique. Des stratégies de fabrication évolutives peuvent être utilisées avec divers matériaux électriques et optiques, ce qui rend les sondes hautement personnalisables en fonction des exigences expérimentales, notamment la longueur, le diamètre et les propriétés mécaniques. Compte tenu de leur réponse inflammatoire négligeable, ces sondes promettent de permettre une nouvelle génération de dispositifs multimodaux facilement réglables pour une interface à long terme et peu invasive avec les circuits neuronaux.

Les enregistrements de microélectrodes sont l'étalon-or pour mesurer l'activité des neurones individuels à haute résolution temporelle dans n'importe quelle région du système nerveux et sont essentiels pour définir le rôle des circuits neuronaux dans le contrôle du comportement. Les réseaux de microélectrodes, tels que les réseaux de l'Utah ou du Michigan, ont permis le suivi de l'activité neuronale distribuée avec une précision de l'ordre de la milliseconde1,2. Cependant, leur grande empreinte et leur rigidité entraînent des lésions tissulaires et une inflammation qui entravent les enregistrements à long terme3,4. Les sondes Neuropixel et en fibre de carbone à la pointe de la technologie ont amélioré ces dispositifs précédents en augmentant la densité des électrodes et en réduisant les dimensions et la rigidité de la sonde5,6,7. Bien que ces sondes aient fait progresser le domaine de l'interfaçage neuronal, les dispositifs de nouvelle génération devraient permettre une stimulation ciblée en plus des enregistrements électriques colocalisés3,8. Les techniques optogénétiques permettent une modulation à grande vitesse de l'activité cellulaire grâce à une expression ciblée et à l'activation d'opsines sensibles à la lumière9. Cependant, étant donné la forte diffusion de la lumière et les propriétés d'absorption élevées du tissu neural, l'interfaçage optogénétique avec les circuits neuronaux profonds nécessite généralement l'implantation de fibres rigides de grand diamètre, ce qui peut rendre cette approche plus invasive que son homologue électrique.

La sonde neurale idéale combinerait les modes optique et électrique tout en conservant de petites dimensions en coupe transversale et des longueurs accordables. La capacité à s'interfacer de manière bidirectionnelle avec des types et des circuits de neurones génétiquement définis est essentielle pour pouvoir finalement comprendre comment le système nerveux calcule et contrôle le comportement. Il est également fondamental pour déterminer la base mécaniste des troubles sensori-moteurs, définir comment l'activité des circuits est affectée par une blessure et comment elle pourrait être restaurée ou facilitée. Les approches d'intégration des modalités optiques et électriques vont de l'ajout de fibres optiques aux réseaux Utah existants à l'optétrode ou à d'autres structures coaxiales électro-optiques intégrées13,14,15,16,17. Ces technologies se sont révélées très prometteuses pour les enregistrements électriques simultanés et la stimulation optique in vivo. Cependant, la nécessité de réduire l'empreinte de l'appareil pour minimiser les réponses immunitaires pour les enregistrements à long terme est toujours présente3,18,19,20,21.

Dans ce travail, nous présentons, à notre connaissance, la plus petite sonde neurale coaxiale multimodale avec un canal électrique à faible impédance entourant un petit noyau central de fibre optique. Ces sondes électro-optiques mécaniquement flexibles (EO-Flex) peuvent être fabriquées avec des diamètres aussi petits que 8 µm et des longueurs jusqu'à plusieurs millimètres à l'aide de noyaux de guides d'ondes optiques en microfibre ou même des diamètres plus petits avec des noyaux optiques en nanofibres. Ils peuvent également être liés directement aux fibres monomodes (SMF) pour créer des interfaces optiques détachables à faible perte qui peuvent être directement connectées au matériel optogénétique standard. Les performances simultanées d'enregistrement électrique et de stimulation optique des sondes EO-Flex sont démontrées dans le cerveau de la souris. Nos expériences montrent que le canal électrique en métal poreux offre une excellente capacité d'enregistrement même avec la petite taille de la sonde. Les faibles pertes optiques de la source à la pointe de <10 dB permettent une stimulation optogénétique robuste chez des souris transgéniques ou viralement transduites exprimant des opsines dans des cellules cibles. Les études sur les implants montrent des réponses immunitaires minimales, ce qui suggère que la sonde entièrement personnalisable et les futurs réseaux haute densité devraient permettre une interface à long terme avec une perturbation minimale du tissu neural environnant.

Les sondes EO-Flex ont été fabriquées à l'aide de noyaux optiques en micro et nanofibres (voir Méthodes). Ici, nous nous concentrerons sur les microfibres de silice pouvant être produites en masse en tant que noyau permettant des sondes d'une longueur supérieure à 3 mm tout en conservant un diamètre <12 µm (Fig. S16a). Cependant, le protocole de fabrication est général et peut être utilisé avec d'autres cœurs optiques, y compris des guides d'ondes en nanofibres d'oxyde métallique de sous-longueur d'onde, pour produire des sondes ultra-miniaturisées (Fig. S3). Pour permettre un couplage efficace au matériel optogénétique, les microfibres ont d'abord été placées sur un substrat de silicium, une extrémité de la fibre dépassant du bord du substrat, puis couplées bout à bout à un SMF clivé (Fig. 1a). Nous avons utilisé l'alignement actif pour maximiser le chevauchement des modes entre la microfibre et le SMF. Le couplage a été verrouillé à l'aide d'une gouttelette d'adhésif optique durcissable aux UV à l'extrémité du SMF (Fig. 1b).

a Des microfibres de silice de longueur définie sont positionnées sur un substrat de silicium pour permettre à une férule chargée de fibre monomode (SMF) de se lier à la microfibre. b (de haut en bas) Les photographies montrent l'alignement actif et le processus de liaison du couplage de la microfibre au SMF. c Schéma de la configuration d'électrodéposition pour le dépôt de sulfonate de poly(3,4-éthylènedioxythiophène) polystyrène (PEDOT:PSS) après la pulvérisation d'oxyde d'iridium (IrOx). d Image optique de la sortie lumineuse d'une sonde depuis le côté lorsque la lumière se reflète à partir d'un miroir et à partir de la facette d'extrémité clivée (encarts de zoom avant) avec et sans lumière laser. (encadré) Image de fluorescence capturant l'angle de cône de la sonde après l'avoir immergée dans une solution de colorant et lancé une lumière bleue (442 nm) dans la sonde. Des micrographies ont été générées au cours de quelques expériences. e Micrographie électronique en coupe d'une sonde EO-Flex après fraisage de l'extrémité montrant les anneaux conducteurs exposés avec le noyau en verre optique (SiOx). Des micrographies électroniques multiples ont été enregistrées pour des sondes similaires résultant en des propriétés similaires. f Données EIS pour les sondes fraisées avec (ligne noire) et sans (ligne verte) le revêtement PEDOT:PSS. L'impédance moyenne est indiquée avec la zone légèrement ombrée représentant un écart type pour n = 4 sondes. g Une vue en coupe de la sonde montrant ses différentes couches de revêtement. h Photographie d'une sonde EO-Flex terminée avec un zoom avant de la région de la pointe en microfibre. Pour les stratégies de mise à l'échelle, voir Fig. S16.

Pour créer une interface détachable robuste pour les tests in vivo, le SMF a été inséré dans une virole en céramique. L'extrémité distale de l'assemblage de la férule a été polie à la machine pour permettre le couplage à un câble de raccordement (Fig. 1g, h). D'autres conceptions d'interface pour différentes applications sont envisageables (Fig. S16). Pour former une couche électriquement conductrice à faible bruit autour de la pointe de la sonde, une couche de 379 ± 43 nm d'oxyde d'iridium (IrOx) a été pulvérisée sur les microfibres, suivie d'une couche de 362 ± 137 nm déposée électrochimiquement de poly(3,4-éthylènedioxythiophène) sulfonate de polystyrène (PEDOT:PSS) (Fig. 1c)22. La nature poreuse d'IrOx a permis une meilleure adhérence de la couche conductrice PEDOT:PSS et améliore les performances électriques globales de la sonde. La sonde a été passivée avec 1,76 ± 0,16 µm de parylène-C pour isoler électriquement la sonde et fournir une surface biocompatible (Fig. S2). Afin d'exposer les surfaces électriques et optiques, un faisceau d'ions focalisé a été utilisé pour cliver la pointe (Fig. 1e ; voir Informations complémentaires). La figure 1g affiche la conception finale de la sonde et la figure 1h montre une photographie d'une sonde terminée. Grâce à la combinaison d'IrOx et de PEDOT:PSS, des impédances électriques <1 MΩ à 1 kHz ont été obtenues à partir de zones d'électrodes <15 µm2 (Fig. 1f).

Les propriétés optiques des sondes ont d'abord été évaluées en imageant l'angle du cône de sortie dans une solution de colorant (Fig. 1d, en médaillon), qui a montré un angle de divergence de 10 à 15°. Il est important de noter qu'une fois les couches de revêtement placées sur la sonde, aucune lumière de diffusion détectable n'est observée à partir de l'interface microfibre/SMF (Fig. 1d) par rapport à la sonde de pré-revêtement (Fig. 1b). Les pertes optiques entre un câble patch couplé au laser et la sortie EO-Flex ont été quantifiées à l'aide de trois longueurs d'onde différentes (473, 543, 600 nm) avec tous les appareils montrant <7 dB (n = 4). Ces valeurs correspondent bien aux résultats simulés pour un désalignement de mode d'environ 2 µm dans le manchon de virole (Fig. S1). La spectroscopie d'impédance électrochimique (EIS) a été réalisée sur les sondes alors qu'elles étaient immergées dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x. Toutes les sondes fabriquées et testées ont montré une impédance électrique moyenne de 844 ± 179 kΩ à 1 kHz (n = 4; Fig. 1f et Fig. S2a – d) après dépôt de gaine et fraisage de la pointe, contre> 10 MΩ avant dépôt PEDOT.

Pour confirmer que les sondes EO-Flex permettent des mesures électriques à haute sensibilité in vivo, nous avons effectué des enregistrements extracellulaires simultanés et une imagerie à deux photons dans le cortex de souris anesthésiées à l'isoflurane avec des cellules marquées par fluorescence (voir Informations complémentaires)23,24. Cette approche a permis la surveillance de l'insertion et du mouvement ciblé de la sonde à travers le tissu (Fig. 2a). Les sondes ont facilement pénétré la dure-mère exposée avec un flambage minimal lors de l'utilisation de l'immersion dans l'eau (Vidéo S1) et ont atteint les régions cibles dans la couche corticale optiquement accessible 2/3 (Fig. S12 et Vidéo S2). Lorsqu'il est monté sur un micromanipulateur à trois axes, un réglage fin de la position latérale de la pointe de la sonde, une fois à l'intérieur du tissu, était possible pour optimiser le rapport signal sur bruit et cibler les neurones individuels. Cependant, le mouvement latéral était généralement limité à <30 µm. En utilisant cette approche, nous avons acquis une activité endogène multi- et mono-unité (Fig. 2b). L'analyse en composantes principales (ACP) et le regroupement gaussien des enregistrements électriques ont été utilisés pour déterminer le nombre d'unités distinctes (Fig. 2c). Les taux de dopage ont été calculés à l'aide d'un algorithme Bayesian Adaptive Kernel Smoother (BAKS) appliqué à toute la durée de l'enregistrement (Fig. 2d)25. La figure 2b–e montre un enregistrement représentatif. À l'aide d'une sonde EO-Flex d'environ 1 mm de long, nous avons également obtenu des enregistrements électriques à partir de zones corticales plus profondes jusqu'à la longueur maximale des sondes. La signature électrique de ces enregistrements suggère que toutes les couches corticales sont accessibles (Fig. S4).

un schéma montrant la configuration utilisée pour les mesures électriques guidées visuellement. L'imagerie à deux photons de la sonde par rapport aux cellules marquées par fluorescence (voir Méthodes) a été utilisée pour suivre son mouvement à travers les tissus et optimiser la position d'enregistrement. (en médaillon) Vue en coupe transversale agrandie de la préparation chirurgicale pour l'imagerie simultanée et les enregistrements électriques. b Exemple d'enregistrement EO-Flex montrant une activité neuronale spontanée dans la couche corticale 2/3 (profondeur = 250 µm) d'une souris anesthésiée à l'isoflurane. Le seuil (ligne rouge) définissant un pic a été fixé à \({{{{{\rm{Threshold}}}}}}=4* {{{{{\rm{median}}}}}}\left(\frac{\left|{{{{{\rm{Recording}}}}}\right|}{0.675}\right)\) sur la base de la littérature publiée36. (région encadrée) Un extrait d'une seconde de l'enregistrement montre une activité multi-unités. c Tracé d'analyse en composantes principales (PC) du regroupement des formes d'onde à l'aide de méthodes de regroupement établies37. d Le taux de dopage sur l'enregistrement d'une minute indiqué en (b) a été calculé à l'aide d'une estimation du noyau bayésien. e Formes d'onde moyennes (lignes pleines) avec un écart type (régions ombrées) pour quatre groupes déterminés par PCA à partir de l'enregistrement en (b).

Ensuite, pour démontrer la capacité des sondes EO-Flex à enregistrer l'activité évoquée périphériquement, nous les avons insérées dans le cortex du tonneau, qui reçoit l'apport sensoriel des moustaches du côté opposé du corps. Tout en faisant avancer la sonde dans le cerveau, nous avons périodiquement dévié les moustaches à l'aide de bouffées d'air alors que l'animal était encore sous anesthésie à l'isoflurane. Une fois l'activité corrélée observée, la position de la sonde (insertion d'environ 900 µm) a été verrouillée en place et l'anesthésie a été désactivée. Les mesures ont commencé 30 à 60 min après que les animaux ont commencé à marcher. Des enregistrements vidéo ont été utilisés pour vérifier les déviations des moustaches induites par les bouffées d'air et enregistrer le comportement de fouettage spontané sous éclairage infrarouge (Fig. 3a – c). De plus, l'activité locomotrice de la souris a été enregistrée à l'aide d'un codeur optique fixé au tapis roulant sphérique sur lequel l'animal était positionné. Les moustaches ont été déviées à l'aide de différentes fréquences d'impulsions (2, 3 et 5 Hz) et largeurs (20 et 50 ms) (Fig. 3f – q), entraînant des augmentations du taux de pointe dépendant du stimulus, qui étaient plus prononcées pendant les périodes de repos (c'est-à-dire en l'absence de fouettement spontané). Pour corroborer davantage le positionnement de la sonde dans le cortex du barillet, nous avons effectué des stimulations électriques médiées par la sonde EO-Flex (impulsions biphasiques de 0 à 300 µA à 100 Hz), entraînant des déviations des moustaches dépendant de l'amplitude du courant (Fig. S5).

a Schéma du montage expérimental. Les moustaches ont été déviées par des stimuli de bouffée d'air délivrés via une micropipette connectée à un système de pression contrôlé par un générateur de fonctions (Picospritzer). Le générateur de fonctions contrôlait également une LED infrarouge pour la synchronisation des données analogiques et vidéo. b Image vidéo montrant l'animal au repos avant la déviation des moustaches. La flèche bleue indique un exemple de moustache. Le cercle rouge indique l'emplacement de la LED infrarouge. c Image vidéo montrant la déviation de la moustache indiquée lors de la délivrance d'une bouffée d'air. d Exemple d'enregistrement EO-Flex (noir) pendant la stimulation des moustaches à 3 Hz (jaune). e Formes d'onde moyennes triées par pointes correspondantes avec un écart type ombré. Différentes formes d'ondes neuronales sont marquées de différentes couleurs. f – h Graphique raster montrant l'activité évoquée par le stimulus des moustaches pour une fréquence de stimulation de 2 Hz (largeur d'impulsion de 50 ms) (f), l'histogramme de temps péristimulus (g) et l'estimation BAKS de la fréquence de déclenchement (h). i – k Tracé raster (i), histogramme de temps péristimulus (j) et estimation BAKS pour une stimulation de 3 Hz (largeur d'impulsion de 50 ms). l–n Tracé raster (l), histogramme de temps péristimulus (m) et estimation BAKS (n) pour une stimulation de 5 Hz (largeur d'impulsion de 50 ms). o–q Tracé raster (o), histogramme de temps péristimulus (p) et estimation BAKS (q) pour une stimulation de 3 Hz (largeur d'impulsion de 20 ms). Panneau (a) créé avec Biorender.com.

Pour démontrer la capacité des sondes EO-Flex à évoquer optiquement l'activité neurale tout en enregistrant simultanément électriquement avec la même sonde, nous avons effectué des expériences sur des souris anesthésiées Thy1-ChR2-YFP avec l'expression du canal ionique activé par la lumière bleue Channelrhodopsin-2 (ChR2) dans les neurones. Les sondes ont été insérées dans la couche corticale 2/3 sous contrôle visuel. Un laser à semi-conducteur pompé par diode (DPSS) de 473 nm, adapté à l'excitation de ChR2, a été couplé à la sonde et les paramètres de stimulation ont été systématiquement balayés (Figs. S6, S8, S9). Nous avons fait varier la fréquence de stimulation (10–50 Hz), la largeur d'impulsion (0,6–9,8 ms) et la puissance de sortie (5–208 µW) pour déterminer les paramètres optimaux pour exciter les neurones exprimant ChR2. En utilisant l'analyse de la forme d'onde sur l'activité électrique enregistrée simultanément, nous avons constaté qu'une puissance minimale de 29 µW (2849 mW mm−2) était nécessaire pour le déclenchement des cellules en synchronisation avec le train d'impulsions optiques (Fig. S6). Dans l'exemple d'enregistrement illustré à la Fig. 4a – b, l'ACP combinée à un ajustement gaussien mixte pour le regroupement des données a donné deux grappes primaires (Fig. 4c) avec deux formes d'onde différentes (Fig. 4d) se produisant pendant la période de stimulation (Fig. 4e – g). Nous avons trouvé une interférence minimale (par exemple, effet Becquerel) entre les canaux optiques et électriques proximaux, comme l'a démontré le test des dispositifs EO-Flex sur des animaux non transgéniques à une puissance optique maximale et des fréquences de stimulation similaires (Fig. S10). Une validation supplémentaire de l'absence de l'effet Becquerel a été démontrée en rétractant la sonde EO-Flex loin des neurones exprimant ChR2 ou en la plaçant dans une solution tampon, tout en pompant optiquement à une puissance laser similaire (208 µW) en utilisant les mêmes trains d'impulsions optogénétiques (Fig. S11). À cette puissance maximale, les circuits neuronaux ont répondu avec un décalage temporel minimal (Fig. S6f) et pouvaient suivre des stimuli de fréquence jusqu'à 40 Hz avant de lutter pour maintenir un déclenchement synchronisé (Fig. S9).

a Activité neuronale évoquée optiquement à l'aide d'un train d'impulsions de 20 Hz (barres bleues) de lumière de 473 nm (largeur d'impulsion de 4,95 ms) à une puissance de pointe de 61 μW cyclé à 1 Hz. La ligne de seuil (rouge) a été définie comme défini36 sur la Fig. 2. b Tracé du taux de pointe pour l'enregistrement en (a). c Tracé de la composante principale (PC) pour l'activité neuronale évoquée optiquement. Les clusters séparés sont colorés différemment. d Formes d'onde moyennes (ligne verte ou noire continue) pour chaque groupe en (c) avec un écart type (région ombrée). e Chaque groupe (noir ou vert de couleur coordonnée) tracé dans le temps avec la fenêtre d'une seule impulsion (barre bleue). f Estimation par lissage du noyau bayésien du taux de pointe pour chaque période de stimulation. g Tracé raster coloré montrant l'occurrence des formes d'onde de (d). h Taux de pointe moyen calculé sur la durée de 1 s d'un seul cycle d'impulsions.

La capacité des sondes EO-Flex à évoquer optiquement l'activité neurale a été vérifiée par imagerie calcique à deux photons chez des souris Vglut2-GCaMP6f injectées avec un vecteur AAV2-CaMKII-C1V1-mCherry (voir Méthodes). Quatre à cinq semaines après l'injection corticale, des sondes EO-Flex ont été insérées dans les régions des couches 2/3 exprimant l'opsine activée par la lumière verte C1V1. Un laser DPSS de 556 nm a été couplé à la sonde EO-Flex et les paramètres de stimulation ont été balayés tout en surveillant simultanément les transitoires de calcium neuronal. Les impulsions optiques délivrées ont entraîné un pic de calcium corrélé dans les neurones positifs pour C1V1 dans le champ de vision (Fig. S12). L'évocation optique réussie de l'activité neuronale a également été vérifiée par des enregistrements électriques simultanés (Fig. S12e). Ensemble, nos données in vivo démontrent la capacité des sondes EO-Flex à enregistrer électriquement et à moduler optiquement l'activité neuronale dans le cerveau intact.

Les sondes EO-Flex permettent de cibler et d'entraîner des cellules exprimant l'opsine à des cadences de tir allant de 10 à 50 Hz (Fig. S9). Alors que la puissance minimale (29 µW) pour activer les neurones de manière fiable est plus élevée que dans les rapports précédents (1–10 mW mm−2)15,26,27, il convient de noter qu'en raison du petit noyau optique des sondes EO-Flex (3,6 µm) et de l'absorption et de la diffusion anticipées de la lumière à partir du tissu, des intensités plus élevées devraient créer des volumes d'éclairage suffisamment grands et puissants pour recruter des neurones avec succès par rapport aux fibres optiques conventionnelles à plus grand noyau. Les simulations Monte Carlo de la Fig. S6b indiquent qu'à une puissance de stimulation de 29 µW, la densité de puissance optique tombe en dessous du seuil optogénétique de 1 mW mm−2 à environ 1,2 mm de la pointe. Même à la puissance de stimulation maximale utilisée dans nos expériences optogénétiques (208 µW ou 20 435 mW mm-2 à l'extrémité de la sonde), nous n'avons observé aucun effet cellulaire indésirable (par exemple, des changements soutenus dans la vitesse de déclenchement ou les niveaux de calcium) (Figs. S10–12). Des études récentes ont suggéré qu'une exposition optique continue avec des puissances <0,25 mW n'entraîne aucun effet de la température sur l'activité neuronale (c'est-à-dire des signaux électriques dégradés pendant la période de stimulation)28. Pour garantir davantage d'effets de chauffage optique minimaux sur le tissu neural, nous avons utilisé des largeurs d'impulsion courtes et des puissances optiques inférieures à 250 µW (Figs. S6–10). Des effets de chauffage minimes sont attendus lors de l'utilisation de ces paramètres d'éclairage, ce qui a été vérifié en appliquant des modèles de chauffage précédemment validés aux sondes EO-Flex (Fig. S7b)29.

Ensuite, nous avons évalué la réponse du cerveau à l'implantation de la sonde. Des sondes EO-Flex ont été implantées dans le cortex de souris hétérozygotes Cx3cr1-GFP avec une microglie marquée pendant 6 et 30 jours. Une fibre multimode de 250 µm de diamètre, couramment utilisée dans les expériences optogénétiques, a été insérée en utilisant les mêmes coordonnées stéréotaxiques mais sur l'hémisphère opposé à des fins de comparaison. Des coupes cérébrales en série ont été préparées qui comprenaient les deux sites d'implantation. Des tranches de tissu ont été co-colorées avec des anticorps anti-GFAP et anti-NeuN pour quantifier l'astrogliose réactive et la perte neuronale, respectivement (n = 4 souris; N = 8 sections par souris) (Fig. 5 et Fig. S14, 15). Au jour 6 après l'implantation, nous avons constaté que la fibre multimode entraînait une perte neuronale significative, une augmentation de 2, 08 ± 0, 23 fois du nombre de microglies et une augmentation de 2, 68 ± 0, 60 fois des niveaux de GFAP (Fig. 5e – g). En revanche, les sondes EO-Flex n'ont montré aucune diminution significative du nombre de cellules NeuN-positives ni augmentation du nombre de microglies ou des niveaux de GFAP autour du site d'insertion (Fig. 5e – g). Au jour 30 après l'implantation, une perte neuronale a de nouveau été observée pour la fibre multimode témoin implantée, ainsi qu'une augmentation de 2, 33 ± 0, 27 fois du nombre de microglies et une augmentation de 2, 81 ± 0, 63 fois des niveaux de GFAP (Fig. 5l – n). En revanche, les sondes EO-Flex n'ont montré aucune diminution significative des cellules NeuN-positives ni augmentation des niveaux de GFAP, mais une légère augmentation du nombre de microglies (Fig. 5l – n). Ces résultats indiquent que les réponses tissulaires à l'insertion ou au mouvement de la sonde EO-Flex pendant la période d'implantation sont négligeables aux moments où les réponses inflammatoires sont généralement les plus importantes, et considérablement plus petites par rapport aux sondes standard utilisées pour les expériences optogénétiques30. Enfin, compte tenu de cette réponse immunitaire minimale, nous avons également effectué des enregistrements chroniques jusqu'à 30 jours après l'implantation de la sonde EO-Flex. Ces enregistrements ont révélé d'excellents rapports signal sur bruit à tous les moments étudiés (jours 0, 1, 2, 6 et 30) (Fig. S13).

a, b Images optiques montrant des coupes cérébrales coronales de 20 µm d'épaisseur autour des sites d'implantation de la fibre multimode (a) et de la sonde EO-Flex (b). La fibre multimode (diamètre, 250 µm) et la sonde EO-Flex (diamètre, 12 µm) ont été avancées à une profondeur d'environ 1 mm dans le cortex. Les images ont été prises 6 jours après l'implantation chez des souris hétérozygotes Cx3cr1-GFP avec des microglies marquées (vert). Les sections ont été co-colorées avec des anticorps anti-NeuN (bleu) et anti-GFAP (magenta) pour marquer les neurones et les astrocytes, respectivement. c, d Image à plus haute résolution d'une région agrandie de (a, b) où se trouvaient les pointes de sonde. e–g Analyse de population (n = 16 sections de deux animaux) montrant l'impact de l'implantation de la fibre multimode ou de la sonde EO-Flex sur le nombre de cellules neuronales (e), la réactivité des astrocytes mesurée par le niveau d'expression de GFAP (f) et la réactivité de la microglie mesurée par le nombre de cellules microgliales (g) pour l'implantation de 6 jours. Les réponses cellulaires ont été quantifiées et moyennées sur deux régions d'analyse de 150 µm × 1 mm flanquant chaque site d'insertion. Pour distinguer la chirurgie des réponses tissulaires liées à la sonde, une craniotomie supplémentaire de taille comparable a été réalisée à 0,7 mm latéralement à chaque site d'implantation du dispositif. La même approche d'analyse a été utilisée pour quantifier les réponses cellulaires sur ce site de chirurgie factice. Des tests t appariés bilatéraux ont déterminé les valeurs P. h, i Images optiques de section coronale du cerveau prises 30 jours après l'implantation de la fibre multimode (h) et de la sonde EO-Flex (i). j, k Image à plus haute résolution d'une région agrandie de (h) et (i) où se trouvaient les pointes de sonde. l–n Analyse de population correspondante (n = 16 sections de deux animaux) montrant le nombre de cellules neuronales (l), la réactivité des astrocytes (m) et la réactivité de la microglie (n) pour l'implantation de 30 jours. Des tests t appariés bilatéraux ont déterminé les valeurs P. La convention suivante a été utilisée pour indiquer les valeurs P : "ns" indique P > 0,05, "*" indique 0,01 < P ≤ 0,05, "**" indique 0,001 < P ≤ 0,01 et "***" indique 0,0001 < P ≤ 0,001. Tous les diagrammes à barres sont présentés sous forme de moyenne ± sem

En résumé, nous rapportons la fabrication de microsondes coaxiales multimodales et démontrons leur capacité à stimuler optiquement et à enregistrer électriquement à partir de circuits neuronaux intrinsèques avec un minimum d'interférences entre les deux modalités. Le faible encombrement et le rapport d'aspect élevé des sondes EO-Flex permettent une interface peu invasive avec les circuits neuronaux. Une réduction supplémentaire de la taille est possible avec cette conception coaxiale utilisant des cœurs de fibre optique plus petits ; cependant, le compromis est une augmentation des pertes optiques et de l'impédance électrique (Fig. S3). Bien que les capacités des sondes n'aient été testées que dans le cerveau, en tant que plate-forme avec un excellent contrôle du diamètre et de la longueur de la sonde, le choix de matériaux de revêtement avec diverses compositions chimiques, une flexibilité mécanique inhérente et une voie claire pour augmenter les densités de sonde (par exemple, traduire le processus de dépôt de gaine en faisceaux de fibres) (Fig. S16c), cette technologie devrait trouver des applications immédiates en tant qu'interfaces peu invasives dans diverses régions du système nerveux, y compris la moelle épinière et les nerfs périphériques.

Le développement de sondes pouvant atteindre des régions cérébrales encore plus profondes est simple avec les protocoles de fabrication développés, car pratiquement toutes les longueurs de microfibres peuvent être générées (Fig. S16a). Cependant, pour un ensemble donné de couches de gaine, la raideur de la sonde diminue avec la longueur. Par conséquent, des sondes plus longues peuvent nécessiter des tactiques supplémentaires pour surmonter les faibles forces de flambage pendant le processus d'insertion (par exemple, des revêtements de sucre solubles ou des couches de polymère rigides)31. Alternativement, une incision chirurgicale dans la dure-mère pourrait faciliter l'insertion de la sonde. Quelle que soit la longueur de la sonde, nos études d'implantation ont démontré que les sondes EO-Flex à faible encombrement ont une réponse immunitaire considérablement réduite par rapport aux fibres multimodes standard.

Des microfibres de silice (diamètres central et total : 3,63 ± 0,31 µm et 5,60 ± 0,42 µm, respectivement) avec des longueurs variant entre 500 µm et 1 cm ont été générées à partir de faisceaux de fibres optiques sangsues (Schott, Part no. 1573179). Après clivage, les fibres individuelles ont été dispersées sur un substrat de silicium. Une aiguille de tungstène montée sur un micromanipulateur à trois axes a été utilisée pour positionner les microfibres près d'un bord du substrat, une extrémité de la fibre étant suspendue à plus de 100 µm du bord.

Pour permettre un couplage optique efficace du guide d'ondes au matériel optogénétique standard, une fibre monomode (SMF) (Thorlabs S405-XP) avec un diamètre de champ de mode (2,8 à 3,4 µm) légèrement inférieur au noyau en microfibre a été choisie. Pour créer une interface détachable robuste pour les tests in vivo, le SMF a été inséré dans une virole en céramique (Thorlabs CF126-10) et fixé en place avec de l'époxy à durcissement rapide (DevCon #20445). Les assemblages de viroles ont ensuite été polis à la machine jusqu'à ce qu'une interface de couplage lisse soit observée à travers une lunette d'inspection de fibre (Thorlabs, FS200), et l'extrémité opposée de la fibre (pour le couplage au guide d'ondes) a été clivée à l'aide d'une pointe en rubis (Thorlabs S90R). L'assemblage de virole a été monté sur une platine à trois axes, et l'extrémité tracée a été manœuvrée dans une gouttelette d'adhésif optique durci aux UV (Norland Optical Adhesive 81) jusqu'à ce qu'une petite gouttelette se forme à l'extrémité. Un couplage efficace entre SMF et micro-/nanofibre a été obtenu en utilisant un alignement actif sous un microscope optique droit (Nikon ; logiciel : Amscope v3.7.9229.20170607) équipé d'un objectif 0,4 NA 20x après couplage d'une source laser He-Ne de 544 nm dans le SMF. Après avoir maximisé le couplage de puissance dans le guide d'ondes en traduisant le SMF, l'adhésif NOA 81 a été fixé en l'exposant à la lumière UV (ligne de 325 nm d'un laser HeCd) pendant une durée de 30 s tout en déplaçant continuellement le faisceau autour de la gouttelette.

Avant de déposer la couche métallique, les assemblages de sondes ont été placés dans un support de bloc en aluminium personnalisé pour masquer la partie inférieure de la virole où la lumière est couplée dans l'assemblage. Cela garantissait que l'interface de couplage optique était masquée pendant la métallisation. Ce bloc a été placé sur un plateau tournant à l'intérieur d'une chambre de pulvérisation (Denton Discovery 18). Une fine couche d'adhérence (<10 nm) de titane (2,5 mTorr, 5 s, 200 W) a été déposée, suivie d'une couche de 300 nm d'épaisseur d'oxyde d'iridium (IrOx) (12 mTorr, 15 min, 100 W, 5 sccm O2 flow) ou 500 nm de platine (Pt) (2,5 mTorr, 20 min, 200 W). L'oxyde d'iridium a été choisi pour sa capacité d'injection de charge ~ 3 fois supérieure à celle des couches de platine conventionnelles, et sa nature poreuse, qui augmente la surface électrochimique de la couche métallique32.

Ensemble, ces procédures ont donné des assemblages de viroles pour un montage reproductible sur une configuration d'imagerie et d'optogénétique in vivo (Fig. 2). Des conceptions d'interface alternatives (par exemple, pour les réseaux de sondes) sont illustrées à la Fig. S16.

Pour abaisser davantage l'impédance électrique des sondes, une couche de poly(3,4-éthylènedioxythiophène)-polystyrène sulfonate (PEDOT:PSS) a été déposée sur l'IrOx. Les sondes ont été immergées (~ 100 µm de la pointe de la sonde) dans une solution 0, 01 M d'EDOT (97%, Millipore-Sigma) avec 2, 5 mg / ml de poly (sulfonate de styrène sodique) (PSS; Millipore-Sigma). Le dépôt électrochimique a été réalisé à l'aide d'une contre-électrode en fil de platine et d'une électrode de référence Ag/AgCl (CHI 111 P, CH Instruments) connectée à un potentiostat électrochimique (VersaSTAT4) fonctionnant en mode galvanostatique réglé pour fonctionner à un courant de 200 nA pendant 5 à 30 s. Cela a donné une couche de polymère de 362 ± 137 nm d'épaisseur (Fig. 1e et Fig. S2). Les microfibres revêtues de PEDOT-IrOx (ou PEDOT-Pt) ont ensuite été passivées avec 1,5 à 2 µm de parylène-C par dépôt chimique en phase vapeur (SCS Labcoater Deposition System; Specialty Coating Systems).

Un faisceau d'ions focalisé (FEI Scios Dual-beam) réglé sur 5 nA à 30 kV a été utilisé pour cliver l'extrémité de la sonde et exposer les canaux électriques et optiques, révélant un diamètre de sonde final de 8 à 12 µm pour les noyaux en microfibre. La spectroscopie d'impédance électrochimique (EIS) a été réalisée avec le Versastat4 (exécutant VersaStudio v.2.60.6) pour déterminer l'impédance de la sonde dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1 × en utilisant les mêmes électrodes de référence et contre-électrodes décrites ci-dessus. L'efficacité du couplage optique a été déterminée en mesurant la sortie de lumière d'un câble de raccordement à fibre optique (Thorlabs, P1405B-FC-5) à l'aide de trois sources lumineuses (473, 543 et 673 nm) couplées de manière interchangeable dans le câble. La puissance lumineuse a été mesurée en plaçant la férule à 5-10 mm de la tête du détecteur d'un wattmètre numérique (Thorlabs, PM100D). Un manchon de férule en céramique (Thorlabs, ADAL1) a ensuite été glissé à mi-chemin sur le câble de raccordement, et différentes sondes EO-Flex ont été glissées dans l'extrémité opposée pour coupler la lumière. La puissance lumineuse de la pointe des sondes EO-Flex a été mesurée à l'aide d'un protocole similaire au câble de raccordement.

Toutes les procédures d'animaux vivants ont été effectuées conformément aux directives des National Institutes of Health (NIH) et ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) du Salk Institute sous le numéro de protocole 13-00022. Pour des expériences optogénétiques et électrophysiologiques combinées, nous avons utilisé des souris mâles Thy1-ChR2-YFP (stock # 007612 ; Jackson Laboratories ; âge : 10 mois) ; pour des expériences combinées d'imagerie calcique, d'optogénétique et d'électrophysiologie, nous avons utilisé des souris mâles Vglut2-GCaMP6f injectées par AAV2-CaMKII-C1V1-mCherry (un croisement personnalisé entre des souris knock-in Vglut2-Cre et Ai95D ; stock #028863 et #024105, respectivement ; Jackson Laboratories ; âge : 3 mois) ; pour la réponse immunitaire et toutes les autres études, nous avons utilisé des souris mâles hétérozygotes Cx3cr1-GFP (stock # 005582 ; Jackson Laboratories ; âge : 9 semaines).

Les procédures chirurgicales suivaient de près les protocoles précédemment établis33,34. En bref, des pipettes en verre à paroi mince ont été tirées sur un extracteur de micropipette Sutter Flaming/Brown (modèle P-97). Les pointes de pipette ont été coupées à un angle aigu sous un grossissement de 10 × en utilisant des techniques stériles. Les diamètres des pointes étaient généralement de 15 à 20 μm. Les pipettes qui ne présentaient pas de biseaux pointus ni de diamètres de pointe plus grands ont été jetées. Des marques millimétriques ont été faites sur chaque aiguille tirée pour mesurer le volume de virus injecté dans le cerveau.

Les souris ont été anesthésiées à l'isoflurane (4 % pour l'induction ; 1 à 1,5 % pour la maintenance) et placées dans un système stéréotaxique assisté par ordinateur avec lecture numérique des coordonnées et ciblage par atlas (Angle Two, Leica). La température corporelle a été maintenue à 36–37 ° C avec un contrôleur de température DC et une pommade ophtalmique a été utilisée pour empêcher les yeux de se dessécher. Une petite quantité de crème dépilatoire (Nair) a été utilisée pour enlever les poils au site d'incision cutanée désigné. La peau a été nettoyée et stérilisée avec un gommage en deux étapes de bétadine et d'éthanol à 70 %. Une incision médiane a été faite commençant juste derrière les yeux et se terminant juste après la suture lambda. Le cuir chevelu a été ouvert et le périoste a été nettoyé à l'aide d'un scalpel et d'une pince pour exposer l'hémisphère souhaité pour calibrer l'atlas numérique et le marquage des coordonnées. Une fois que les points de référence (bregma et lambda) ont été positionnés à l'aide de la pointe de la pipette et entrés dans le programme, la cible souhaitée a été définie sur l'atlas numérique. La pipette d'injection a été déplacée avec précaution vers le site cible (coordonnées : AP -1,5 mm, ML 1,5 mm). Ensuite, le site de craniotomie a été marqué et une micro-perceuse électrique avec une mèche cannelée (diamètre de pointe de 0,5 mm) a été utilisée pour amincir une partie de 0,5 à 1 mm de diamètre de l'os au-dessus du site d'injection cible. Une fois que l'os était suffisamment mince pour fléchir doucement, une aiguille stérile de 30 G avec une seringue attachée a été utilisée pour couper et soulever soigneusement un petit segment d'os (0,3 à 0,4 mm).

Pour l'injection, une goutte du virus a été soigneusement pipetée sur du parafilm (1 à 2 μl) pour remplir l'aiguille d'injection tirée avec le volume souhaité. Une fois chargée avec un volume suffisant, l'aiguille d'injection a été lentement abaissée dans le cerveau jusqu'à ce que la profondeur cible (DV 0,2 mm) soit atteinte. Une pression manuelle a été appliquée à l'aide d'une seringue de 30 ml connectée par une gaine thermorétractable et 0, 4 μl du vecteur AAV2-CaMKII-C1V1-mCherry (6, 1E + 12 VP / ml; non dilué; UNC Vector Core) a été injecté lentement sur 5 à 10 min. Une fois le virus injecté, la soupape de pression de la seringue était verrouillée. La position a été maintenue pendant environ 10 min pour permettre au virus de se propager et pour éviter le reflux lors de la rétraction de l'aiguille. Après l'injection, la peau a été suturée le long de l'incision. Les souris ont reçu du Buprenex SR sous-cutané (0,5 mg par kg) et on les a laissées récupérer avant de les placer dans leur cage d'origine. Le vecteur a été autorisé à s'exprimer pendant 4 à 5 semaines avant les enregistrements in vivo.

Les procédures chirurgicales ont suivi de près les protocoles établis23,35. En bref, des souris ont été anesthésiées avec de l'isoflurane (4 à 5 % pour l'induction ; 1 à 1,5 % pour l'entretien) et implantées avec une plaque de tête sur un lit chirurgical personnalisé (Thorlabs). La température corporelle a été maintenue à 36–37 °C avec un système de contrôle de la température à courant continu et une pommade ophtalmique a été utilisée pour empêcher les yeux de se dessécher. Une crème dépilatoire (Nair) a été utilisée pour enlever les poils au site d'incision cutanée désigné. La peau a été soigneusement nettoyée et désinfectée avec un gommage en deux étapes de bétadine et d'éthanol à 70 %. Une partie du cuir chevelu a été enlevée chirurgicalement pour exposer les segments de crâne frontal, pariétal et interpariétal. Les bords du cuir chevelu ont été attachés aux côtés latéraux du crâne à l'aide d'un adhésif compatible avec les tissus (Vetbond; 3 M). Une plaque métallique usinée sur mesure a été fixée au crâne avec du ciment dentaire (cat. #H00335; Coltene Whaledent), permettant à la tête d'être stabilisée avec un support personnalisé. Les souris ont reçu du Buprenex SR (0,5 mg/kg) avant le soulagement de l'anesthésie et on les a laissées récupérer pendant au moins trois jours avant de poursuivre la préparation.

Pour l'imagerie combinée et les enregistrements électrophysiologiques, une craniotomie d'environ 2 mm × 4 mm de diamètre a été réalisée sur la zone cible (par exemple, le site d'injection du vecteur AAV). La dure-mère recouvrant le cortex est restée intacte. Le mouvement des tissus a été contrôlé en recouvrant le tissu exposé d'une solution d'agarose à 1 % et d'une lamelle. La lamelle a été fixée au crâne avec du Vetbond (3 M) et du ciment dentaire. Pour permettre l'entrée de la sonde dans le cortex, l'agarose et la lamelle ont été coupés d'un côté pour être au ras de la craniotomie. Les enregistrements ont commencé immédiatement après la préparation de la fenêtre optique. La profondeur de l'anesthésie a été surveillée tout au long de l'expérience et ajustée au besoin pour maintenir un rythme respiratoire d'environ 55 à 65 respirations par minute. Une solution saline a été complétée au besoin pour compenser la perte de liquide.

Pour les mesures électro-optiques dans des conditions éveillées, les souris ont d'abord été habituées à l'appui-tête sur un tapis roulant sphérique (généralement trois séances, 30 à 90 min/séance, une séance/jour sur trois jours consécutifs). Après accoutumance, une craniotomie d'environ 0, 3 à 0, 5 mm de diamètre a été réalisée sur la zone cible (cortex du barillet; coordonnées: AP -1, 0 mm, ML 3, 0 mm) sous anesthésie générale. Les souris ont ensuite été transférées sur le tapis roulant sphérique et autorisées à se remettre de l'anesthésie pendant au moins 30 à 60 minutes, selon la durée qu'elles avaient passée sous anesthésie. Après des mesures électro-optiques, la sonde a été verrouillée en position en couvrant d'abord l'interface sonde/tissu avec une solution d'agarose à 1 %, puis en appliquant du Vetbond (3 M) et du ciment dentaire, fixant ainsi la virole au crâne. Les souris ont été autorisées à récupérer dans leur cage d'origine avant les enregistrements ultérieurs à des jours différents.

Pour caractériser les propriétés électrophysiologiques des sondes EO-Flex in vivo, nous avons effectué des enregistrements extracellulaires à une ou plusieurs unités dans le cortex de souris anesthésiées à l'isoflurane et éveillées, similaires à nos travaux précédents23,24. Le canal électrique des sondes EO-Flex était connecté à la borne positive d'un étage de tête à haute impédance (amplificateur CA à microélectrode modèle 1800, systèmes AM) à l'aide d'un adaptateur personnalisé, tandis que la borne négative et la masse étaient connectées à un fil Ag/AgCl inséré au-dessus du cortex cérébelleux. L'adaptateur se composait d'un bloc en céramique avec une extrémité de câble de raccordement intégrée et un clip en cuivre amovible soudé à un fil d'étage de tête à un seul noyau. Les sondes EO-Flex ont été accouplées à cet adaptateur en glissant un manchon de férule sur l'extrémité du câble de raccordement, en glissant la sonde dans cet assemblage, puis en abaissant le clip en cuivre pour entrer en contact avec la couche métallique sur la férule EO-Flex.

Pour permettre une insertion tissulaire ciblée et un positionnement précis de la sonde, l'adaptateur a été monté sur un micromanipulateur motorisé (MP-225, Sutter Instrument Company) orienté à un angle défini par rapport au crâne (par exemple, ~ 60 degrés pour l'imagerie et l'électrophysiologie combinées, et ~ 0 degrés pour les mesures sans imagerie). Après avoir positionné la pointe de la sonde EO-Flex près du bord de la craniotomie, quelques gouttes de sérum physiologique ont été pipetées sur l'ouverture du crâne pour faciliter l'insertion mécanique à travers l'interface tissulaire (Fig. 2a).

Le positionnement précis a été facilité en faisant passer la sortie de l'amplificateur différentiel à travers un haut-parleur pour servir de retour auditif pour la proximité de la sonde avec les cellules actives. Le signal d'électrode brut a été amplifié, filtré (coupure basse, 300 Hz ; coupure haute, 5 kHz ; gain, 1000×), numérisé (20 kHz ; en utilisant DAQExpress 2.0) et stocké sur disque pour une analyse hors ligne. Le positionnement de la pointe de la sonde près des corps cellulaires neuronaux a été en outre facilité par une rétroaction visuelle dans des expériences impliquant l'imagerie chez des souris transgéniques exprimant un indicateur fluorescent.

La stimulation électrique (Fig. S5) impliquait la délivrance d'impulsions de courant par sonde EO-Flex (amplitude de 0 à 300 µA, fréquence de stimulation de 100 Hz, largeur d'impulsion de 0,2 ms, période de stimulation de 1 Hz) avec un stimulateur d'impulsions isolé (modèle 2100; AM Systems) connecté à un générateur de fonctions.

Le cortex du tonneau dans un hémisphère donné reçoit des informations sensorielles de moustaches situées sur le côté opposé du corps. Pour dévier les moustaches contralatérales à l'emplacement d'enregistrement de la sonde, nous avons fourni des bouffées d'air avec une micropipette reliée par un tube en plastique à un système de pression contrôlé par un générateur de fonctions (Picospritzer III; Parker Hannifin Co.). Le générateur de fonctions actionnait également une LED infrarouge positionnée à l'extérieur de l'animal mais dans le champ de vision de la caméra vidéo pour synchroniser les données analogiques et vidéo. La micropipette a été connectée à un micromanipulateur motorisé (MP-225, Sutter Instrument Company), permettant un contrôle précis des moustaches stimulées. La pression de l'air était dirigée loin de la peau et des yeux et délivrée dans la direction rostra-caudale. Les stimuli de bouffée d'air consistaient en 2 s "on" suivis de 2 s "off", avec des fréquences d'impulsion variables (2–5 Hz) et des largeurs (20–100 ms).

L'imagerie in vivo a été réalisée23,33 en utilisant un microscope à objectif mobile (Sutter Instrument Company) équipé d'un laser femtoseconde Ti:Sapphire (Chameleon Ultra II, Coherent), deux canaux de détection de fluorescence (filtres d'émission : ET525/70 M et ET605/70 M (Chroma) ; séparateur de faisceau dichroïque : 565DCXR (Chroma) ; tubes photomultiplicateurs : H7422-40 GaAsP (Ham amatsu)), et le logiciel d'acquisition d'images MPScope (Kleinfeld lab, UCSD). La longueur d'onde d'excitation laser a été fixée à 920 nm. La puissance laser moyenne était <10–15 mW à la surface des tissus et ajustée avec la profondeur pour compenser la perte de signal due à la diffusion et à l'absorption. Un objectif à immersion dans l'eau 16 × 0,8 NA (CFI75, Nikon) ou 40 × 0,8 NA (LUMPLFLN, Olympus) a été utilisé pour la diffusion et la collecte de la lumière. L'activité calcique spontanée et évoquée optiquement a été enregistrée dans des plans optiques près de la pointe de la sonde (fréquence d'images, 8,14 Hz). Pour minimiser les artefacts médiés par l'effet Becquerel dans les enregistrements électriques, la puissance du laser d'imagerie a été réduite au minimum. Pour enregistrer les transitoires de calcium évoqués optiquement dans les expériences optogénétiques, nous avons synchronisé la fréquence d'images avec la livraison du train d'impulsions optiques et ajusté la phase de sorte que les régions devant la pointe de la sonde soient balayées lorsque le laser DPSS était éteint (Fig. S12).

Pour exciter ChR2 ou C1V1, respectivement, la lumière d'un laser DPSS de 200 mW 473 ou 556 nm (CNI), directement modulée par un signal de générateur de fonction externe, a été couplée à la sonde. Le couplage de la lumière dans la sonde a été obtenu en glissant l'extrémité polie de la férule dans un manchon en céramique, puis en la glissant sur l'extrémité d'un câble de raccordement à fibre personnalisé. Chaque essai de stimulation a duré environ 60 s, les 5 à 10 s initiales étant destinées à l'enregistrement de l'activité spontanée avant la délivrance du train d'impulsions optiques (puissance de stimulation, 6 à 208 µW ; largeur d'impulsion, 0,6 à 9,8 ms ; fréquence de stimulation, 10 à 50 Hz ; durée, 1 s ; intervalle inter-stimulus, 1 s entre les trains d'impulsions).

Des souris hétérozygotes Cx3cr1-GFP (mâles, âgés de 9 semaines) avec une microglie marquée ont été implantées avec une sonde EO-Flex et une fibre multimode de 250 μm de diamètre adaptée à la stimulation cérébrale profonde optogénétique sur les hémisphères opposés (± 1, 45 mm de la ligne médiane). Pour l'implantation, une micro-perceuse électrique avec une mèche cannelée (diamètre de pointe de 0,5 mm) a été utilisée pour amincir une partie de l'os de 0,5 à 1 mm de diamètre. Une fois que l'os était suffisamment mince pour fléchir doucement, une aiguille stérile de 30 G avec une seringue attachée a été utilisée pour couper et soulever soigneusement un petit segment d'os (0,3 à 0,4 mm). La sonde ou la fibre multimode a été avancée à travers cette ouverture sous contrôle visuel jusqu'à une profondeur d'environ 1 mm à l'aide d'un système stéréotaxique assisté par ordinateur (Angle Two, Leica). Du ciment dentaire a été utilisé pour fixer les dispositifs en place. Le collage ferme du ciment dentaire au crâne a été facilité en le scarifiant avec un grattoir à os (Fine Science Tools). Pour distinguer la chirurgie des réponses tissulaires liées à la sonde, nous avons effectué des craniotomies supplémentaires à 0,7 mm latéralement des sites d'implantation du dispositif (Figs. S14, S15). Pour évaluer les réponses inflammatoires des tissus, les souris ont été sacrifiées 6 ou 30 jours après l'implantation du dispositif en utilisant une asphyxie au CO2 conformément aux directives de l'IACUC. La perfusion transcardiale a été réalisée avec du saccharose à 10 % dans du PBS, suivi de PFA à 4 % fraîchement préparé dans du PBS. Les deux hémisphères ont été post-fixés dans du PFA à 4 % dans du PBS pendant une nuit, puis infiltrés dans du saccharose à 30 % dans du PBS pendant un jour et congelés instantanément dans un milieu de congélation de tissu TBS. Les hémisphères implantés ont été cryo-sectionnés par voie coronale à 20 μm, séchés à l'air pendant la nuit, puis traités pour la coloration. Les coupes ont été incubées pendant une nuit à 4 ° C avec un anticorps primaire dilué dans un tampon de blocage, puis lavées dans du PBS 0, 1% Tween-20 et incubées pendant deux heures à 22–24 ° C dans l'obscurité avec des anticorps secondaires couplés à un fluorophore. Les sections ont été lavées, scellées avec Prolong Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific) et stockées à 4 ° C. Les anticorps primaires comprenaient anti-GFAP (souris monoclonale ; EMD Millipore ; cat. #MAB3402 ; RRID : AB_94844 ; dilution 1:250) et anti-NeuN (lapin polyclonal ; EMD Millipore ; cat. #ABN78 ; RRID : AB_10807945 ; dilution 1:100). Les anticorps secondaires (1:100) comprenaient l'anti-lapin de chèvre Alexa Fluor 405 (Thermo Fisher Scientific ; cat. #A-31556 ; RRID : AB_221605) et l'anti-souris de chèvre Alexa Fluor 633 (Thermo Fisher Scientific ; cat. #A-21052 ; RRID : AB_2535719). L'imagerie confocale des coupes de tissus colorées a été réalisée sur un Zeiss LSM 710 (logiciel : ZEN Black, Zeiss v2011). Des piles z en mosaïque à trois canaux ont été acquises pour produire des images de coupes de tissus entiers (Fig. 5 et Figs. S14, S15). La taille de l'image était de 1024 × 1024 pixels assemblés en 3–5 × 3–5 tuiles. Les images ont été prises avec un objectif adapté à l'air Olympus 20 × 0,8 NA.

L'activité neuronale était considérée comme un pic si son amplitude franchissait un seuil déterminé par \({{{{\rm{Seuil}}}}}}=4* {{{{{\rm{médiane}}}}}}\left(\frac{{{{{{\rm{|Enregistrement|}}}}}}}{0,675}\right)\) avec le nombre de clusters optimisé selon la métrique de Calinksi-Harabasz pour l'analyse de cluster37 calculée dans MATLAB (R2019b). Les taux de tir moyens ont été calculés à l'aide du Bayesian Adaptive Kernel Smoother (BAKS) (v2017 ; https://github.com/nurahmadi/BAKS). Des simulations de Monte Carlo ont été utilisées pour déterminer le volume de propagation et d'illumination de la sonde EO-Flex à différentes puissances (Fig. S6b).

Des profils de chauffage optogénétiques ont été créés à l'aide de modèles précédents29 utilisant l'équation de bio-chaleur de Pennes. Les paramètres de simulation étaient pour un rayon optique de sonde EO-Flex de 1,8 µm, une longueur d'onde de 470 nm, une puissance de 1 mW ou 208 µW et un rayon cylindrique de 10 µm pour la moyenne de température dans les simulations basées sur le temps (Fig. S7).

Les tracés péristimulus corrélant les stimuli optiques avec les événements de pointe ont été calculés à l'aide de l'optimisation de la bande passante du noyau, qui s'est avérée estimer avec précision le taux de pointe sous-jacent (Fig. 4b)25.

L'analyse des données d'imagerie calcique à deux photons a été réalisée à l'aide de Suite2p (Fig. S12)38. Un pic de calcium évoqué optiquement a été observé dans les plans optiques près de la pointe de la sonde. Notre analyse s'est concentrée sur les plans optiques dans lesquels au moins trois régions d'intérêt (ROI) de taille cellulaire ont répondu de manière cohérente tout au long de la période de stimulation.

Les données d'immunomarquage ont été traitées, analysées et tracées à l'aide des logiciels ImageJ (v1.53f51), Imaris (v9.2 ; Oxford Instruments) et Prism (v8.4.3 ; GraphPad Prism). Toutes les données ont été représentées sous forme de moyenne ± sem La taille des échantillons de groupe a été choisie en fonction des études précédentes et de l'analyse de puissance. Des tests t appariés bilatéraux ont déterminé les valeurs P. La convention suivante a été utilisée pour indiquer les valeurs P : "ns" indique P > 0,05, "*" indique 0,01 < P ≤ 0,05, "**" indique 0,001 < P ≤ 0,01 et "***" indique 0,0001 < P ≤ 0,001.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données sources sont fournies avec ce document. Des données supplémentaires à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles sur demande auprès des auteurs correspondants. Les données sources sont fournies avec ce document.

Le code personnalisé utilisé pour traiter les données et créer les figures est disponible sur GitHub (https://github.com/Spencer-W/EO-Flex-Algorithms.git). Il sera également disponible sur demande auprès des auteurs correspondants.

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Nous tenons à remercier les Drs. Anis Husain et Rob Saperstein (Ziva Corporation) pour les discussions techniques et les simulations électromagnétiques des premiers prototypes et conceptions EO-Flex. Nous tenons également à remercier Pavel Shekhtmeyster (Salk Institute) pour l'assistance technique avec les expériences d'optogénétique, et Ben Temple et Elischa Sanders (Salk Institute) pour des conseils sur l'analyse des données électrophysiologiques. De plus, nous tenons à remercier Samir Damle (UCSD) pour sa discussion et son aide concernant les processus de salle blanche. Ce travail a été parrainé par le programme de prescriptions électriques (ElectRx) du Bureau des technologies biologiques (BTO) de la Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) sous les auspices du Dr Douglas Weber par le biais du DARPA Contracts Management Office Grant/Contract No. HR0011-16-2-0027 (à DJS, SE et AN). Ce projet a également été soutenu par l'UCSD Kavli Institute for Brain and Mind (Grant No. 2018-1492 to DJS and AN) et les National Institutes of Health des États-Unis (R01 NS108034, U19 NS112959 et U01 NS103522 to AN, et P30CA014195 to the Salk Institute). Ce travail a été effectué en partie à la San Diego Nanotechnology Infrastructure (SDNI) de l'UCSD, membre de la National Nanotechnology Coordinated Infrastructure, qui est soutenue par la National Science Foundation (Grant ECCS-1542148 to UC San Diego).

Département de génie électrique et informatique, Université de Californie, San Diego, La Jolla, CA, 92093, États-Unis

Spencer Ward et Sadik Esener

Département de nanoingénierie, Université de Californie, San Diego, La Jolla, CA, 92093, États-Unis

Conor Riley, Jenny Nguyen, Sadik Esener et Donald J.Sirbuly

Waitt Advanced Biophotonics Center, Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, Californie, 92037, États-Unis

Erin M. Carey et Axel Nimmerjahn

Science et génie des matériaux, Université de Californie, San Diego, La Jolla, CA, 92093, États-Unis

Donald J.Sirbuly

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SW, CR, SE, AN et DJS ont conceptualisé les sondes ; SW, CR et JN ont fabriqué, caractérisé et testé les sondes ; SW, EMC et AN ont réalisé les expériences biologiques ; SE, AN et DJS ont obtenu le financement et supervisé l'étude ; SW, AN et DJS ont analysé les données et rédigé l'article ; tous les auteurs ont révisé et édité le manuscrit.

Correspondance à Axel Nimmerjahn ou Donald J. Sirbuly.

L'UC San Diego a déposé une demande de brevet sur ce travail (demande n ° 63/076 328), dans laquelle SW, CR, SE, AN et DJS sont co-inventeurs. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Guosong Hong et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Ward, S., Riley, C., Carey, EM et al. Microsondes coaxiales électro-optiques mécaniquement flexibles pour une interface peu invasive avec des circuits neuronaux intrinsèques. Nat Commun 13, 3286 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30275-x

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Reçu : 10 novembre 2020

Accepté : 22 avril 2022

Publié: 07 juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-30275-x

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