Rapide et étiquette

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 21413 (2022) Citer cet article

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Dans ce travail, nous démontrons le développement d'un biocapteur électrochimique rapide et sans étiquette pour détecter Listeria monocytogenes à l'aide d'un nouveau matériau de nanobrosse thiomère stimulus-réponse. Les nanobrosses ont été développées via une co-déposition simultanée en une étape de nanoplatine (Pt) et de thiomères d'alginate (ALG-thiomère). La plate-forme de nanobrosse ALG-thiomère/Pt a augmenté de manière significative la surface électroactive moyenne des électrodes de 7 fois et a maintenu les propriétés d'actionnement (gonflement osmotique stimulé par le pH) de l'alginate. Le comportement diélectrique pendant l'actionnement de la brosse a été caractérisé avec des sondes redox chargées positivement, neutres et négativement au-dessus et au-dessous du point isoélectrique de l'alginate, indiquant que la charge de surface ALG-thiomère joue un rôle important dans l'acquisition du signal. La plateforme ALG-thiomère a été biofonctionnalisée avec un aptamère sélectif de la protéine internaline A sur Listeria pour des applications de biodétection. Le chargement d'aptamères a été optimisé et diverses stratégies de capture de cellules ont été étudiées (brosse étendue ou effondrée). La capture cellulaire maximale se produit lorsque l'ALG-thiomère/aptamère est dans la conformation étendue (pH > 3,5), suivie d'une mesure d'impédance dans la conformation effondrée (pH < 3,5). De faibles concentrations de bactéries (5 UFC mL-1) ont été détectées à partir d'une matrice alimentaire complexe (bouillon de poulet) et des tests de sélectivité contre d'autres bactéries Gram-positives (Staphylococcus aureus) indiquent que l'affinité de l'aptamère est maintenue, même à ces valeurs de pH. Le nouveau matériau souple hybride est parmi les plus efficaces et les plus rapides (17 min) pour la biodétection de L. monocytogenes à ce jour, et ne nécessite pas de prétraitement d'échantillon, constituant une nouvelle plate-forme matérielle prometteuse pour la détection de petites molécules ou cellules.

Listeria monocytogenes est une bactérie virulente d'origine alimentaire omniprésente dans l'environnement (sol et eau) qui cause des centaines de décès aux États-Unis chaque année1,2. Chaque année, près de 48 millions de cas de maladies d'origine alimentaire sont signalés, dont près de 19 % sont dus à une infection à Listeria monocytogenes, ce qui a un impact économique négatif potentiel de 15 milliards de dollars en termes de coûts de santé, de perte de productivité et de décès3,4. Avec des symptômes tels que douleurs musculaires, nausées, diarrhée, vomissements et frissons1, L. monocytogenes est l'un des agents pathogènes d'origine alimentaire les plus meurtriers, avec un taux de mortalité pouvant atteindre 30 % chez les personnes à haut risque5,6. Elle est particulièrement dangereuse pour les femmes enceintes, bien qu'elles guérissent généralement, leurs bébés peuvent ne pas survivre2.

Listeria monocytogenes est un agent pathogène difficile à surveiller dans les environnements de transformation des aliments en raison de sa capacité à proliférer dans des conditions de faible teneur en humidité, de salinité élevée ou à des températures associées aux réfrigérateurs/congélateurs courants7. Une règle de tolérance zéro pour L. monocytogenes dans les aliments prêts à consommer a été mise en place par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis, le Département de l'agriculture des États-Unis (USDA) et l'Union européenne (UE)1, aggravée par le nombre croissant de rappels d'aliments liés à la contamination par Listeria ces dernières années8, ce qui renforce encore le besoin de méthodes de détection des agents pathogènes en temps réel qui peuvent identifier les produits alimentaires contaminés avant qu'ils n'atteignent le public.

L'état de l'art actuel pour la détection de Listeria dans les usines de transformation des aliments, y compris les comptages viables totaux (TVC), ELISA (dosages immuno-enzymatiques) et PCR (réaction en chaîne de la polymérase), sont susceptibles d'erreurs et de fausses lectures, et nécessitent des paramètres de laboratoire coûteux avec un personnel hautement qualifié pour être complétés9,10. Les résultats des tests de ces méthodes sont considérablement retardés en nécessitant deux étapes d'enrichissement consécutives (jusqu'à 48 h) pour concentrer/amplifier les bactéries avant une étape de détection qualitative11, car ces méthodes manquent de sensibilité [~ 100 UFC mL−1 limites de détection (LOD)]12,13 et ne peuvent pas détecter directement de faibles niveaux d'agents pathogènes dans des échantillons complexes tels que des milieux, du bouillon ou des tissus homogénéisés.

Les techniques de détection électrochimique sont largement étudiées pour différentes applications en raison de leurs avantages inhérents de robustesse, de réponse rapide, de facilité d'utilisation, de miniaturisation, de sensibilité élevée, de faibles limites de détection, de petits volumes d'analyte, de capacité à travailler avec des échantillons troubles et de capacités sans étiquette12,14. Ces propriétés sont importantes à prendre en compte lors de l'analyse d'échantillons environnementaux et alimentaires dans une installation de transformation où des dispositifs conviviaux et une préparation simple des échantillons sont nécessaires15,16. Le dépôt de nanoparticules métalliques (comme le platine) et/ou de polymères à la surface des capteurs électrochimiques est connu pour améliorer considérablement la surface et/ou la conductivité électrique, en plus d'améliorer l'immobilisation de l'agent de bioreconnaissance, ce qui se traduit par une sensibilité plus élevée, une capture plus rapide et une meilleure détection des bactéries cibles17. Le rôle des nanoparticules de platine dans le domaine de la biodétection a été récemment examiné par Yu et al.18, qui résument leurs propriétés, notamment des densités de courant élevées, un transport de masse rapide et des propriétés électrocatalytiques améliorées qui se traduisent par une amélioration des indicateurs de performance clés du capteur19,20,21,22.

Les aptamères sont des oligonucléotides simple brin et, s'ils sont sélectionnés correctement et appliqués dans le tampon de liaison correct, ils présentent une forte affinité envers les cibles23. Les aptamères se lient spécifiquement via les interactions des cibles et des structures exposées24,25. Les aptamères présentent de nombreux avantages par rapport aux anticorps, notamment un faible coût de synthèse, une reproductibilité élevée, une stabilité thermique élevée et la capacité de modifier et/ou d'intégrer divers groupes fonctionnels (par exemple, biotinylation, thiolation, etc.)25,26. Des revues complètes sur les technologies basées sur les aptamères pour la détection des agents pathogènes d'origine alimentaire résument les développements récents des biocapteurs optiques et électrochimiques (c'est-à-dire les aptasensors)24,27,28, y compris les plateformes qui utilisent des billes magnétiques conjuguées à des aptamères d'ADN et un capteur à fibre optique fonctionnalisé par des aptamères pour la détection des cellules L. monocytogenes à partir de produits carnés prêts à consommer contaminés29. Hills et al.30 et Oliveira et al.31 ont rapporté un mécanisme de détection pour la détection de L. monocytogenes dans des échantillons alimentaires en utilisant l'actionnement de nanobrosses distinctes de chitosan-aptamère à l'aide de l'aptamère découvert par Ohk et al.29. Récemment, Sidhu et al.32 ont développé un aptasensor utilisant des microélectrodes interdigitées en platine fonctionnalisées avec ce même aptamère d'ADN pour Listeria spp. détection dans les bouillons de légumes et les milieux hydroponiques en incorporant le capteur dans un piège à particules/sédiments pour l'analyse de l'eau d'irrigation sur site.

L'utilisation de polymères sensibles aux stimuli pour l'actionnement dans les applications de détection a attiré une attention croissante ces dernières années, comme le résume une récente revue de Hu et al.33. Les polymères sensibles aux stimuli subissent des changements majeurs de solubilité, de volume et/ou de conformation en réponse à des stimuli externes, et ont été utilisés pour imiter la réactivité naturelle aux changements externes de l'environnement observés dans les systèmes vivants33,34,35. L'alginate de sodium est un polysaccharide naturel non toxique, biodégradable et peu coûteux contenant des acides mannuroniques et guluroniques répétés. L'alginate est une molécule anionique avec un pKa d'environ 3,5. Au-dessus du pKa, l'alginate est hydrophile et dans les environnements inférieurs à ce pH, il est hydrophobe36,37. Des travaux antérieurs ont utilisé l'actionnement de polymères pour améliorer la capture de bactéries38 et récemment Hills et al.30 et Giacobassi et al.39 ont étudié l'actionnement de polymères sensibles aux stimuli pour la capture et la détection d'agents pathogènes dans des milieux complexes. Ces études ont démontré avec succès qu'en contrôlant l'actionnement du polymère à l'échelle microscopique, les agents pathogènes peuvent être capturés lorsque le polymère est étendu et la transduction du signal est améliorée après l'effondrement du polymère à la surface du capteur30,39. Cependant, ces études antérieures utilisaient des nanoparticules métalliques et des polymères dans un dépôt couche par couche pour produire les capteurs30,40, nécessitant un processus de fabrication en plusieurs étapes. L'un des plus grands défis de ces travaux antérieurs était d'attacher la nanobrosse à la surface, suivie d'une biofonctionnalisation, qui utilisait des techniques de réticulation non spécifiques, et le contrôle du degré d'attache de surface par rapport à l'immobilisation des biorécepteurs était difficile.

Ici, nous nous concentrons sur le développement d'une co-électrodéposition en une étape de thiomères d'alginate et de nanoplatine en tant que plate-forme aptasensor. Nous nous appuyons sur cette plateforme unique de thiomère d'alginate (ALG-thiomère) pour développer un biocapteur rapide et sans étiquette pour détecter L. monocytogenes. Des études antérieures ont montré la co-électrodéposition d'alginate et d'autres matériaux conducteurs tels que le graphite et le MnO2-C41,42, mais à notre connaissance, notre travail est le premier à montrer l'électrodéposition simultanée d'ALG-thiomères et de platine pour la biodétection, ce qui ouvre un domaine de recherche nouveau et passionnant pour le développement de nano-biocapteurs. Nous avons optimisé les conditions de dépôt d'ALG-thiomère sous différentes combinaisons de tension, de concentration d'ALG-thiomère et de cycles de sonoélectrodéposition, atteignant jusqu'à sept fois la surface électroactive pour les meilleures conditions. Nos résultats montrent que le rapport signal sur bruit le plus élevé a été atteint lorsque la capture cellulaire s'est produite dans la conformation en brosse étendue et la détection dans la conformation en brosse effondrée. Enfin, nous démontrons que le biocapteur ALG-thiomer/Pt nanobrush peut détecter sélectivement L. monocytogenes dans une matrice alimentaire à des concentrations aussi faibles que 5 UFC mL-1 et en présence d'autres cellules Gram-positives en moins de 17 min sans avoir besoin de préconcentration d'échantillon ou de techniques de marquage redox.

Le phosphate de sodium dibasique, le phosphate de potassium monobasique, l'hydroquinone (C6H4(OH)2, l'acide chloroplatinique (8 % p/p) et le chlorure d'hexaamineruthénium(III) (Ru(NH3)6Cl3) ont été acquis auprès de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO). La suspension d'alumine (0,05 µm) et les microsuspensions de diamant polycristallin (3 µm et 1 µm) ont été achetées auprès de Buehler. (Lake Bluff, IL). La référence argent/chlorure d'argent (Ag/AgCl), le travail platine/iridium (Pt/Ir, 1,6 mm de diamètre) et les électrodes auxiliaires en platine ont été acquis auprès de BASinc (West Lafayette, IN). L'acétate de plomb (30 % p/v) a été obtenu auprès de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). Le 4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC) a été acquis auprès de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA), le ferrocyanure de potassium trihydraté (K4Fe(CN)6·3H2O) a été acquis auprès de Ward's Science (Rochester, NY), le chlorhydrate de cystéine monohydraté et le ferricyanure de potassium (K3Fe(CN)6) ont été acquis auprès de JT Baker (Phillipsburg, NJ). Le sel de sodium de l'acide alginique (faible viscosité), le N-hydroxysuccinimide (NHS), le fil de platine (99,95 % Pt, 1,5 mm de diamètre), le 5,5′-dithiobis-(acide 2-nitrobenzoïque) (réactif d'Ellman) et le tampon acide 2-(morpholino)éthanesulfonique) (MES) ont été obtenus auprès d'Alfa Aesar (Ward Hill, MA). Les aptamères créés par Ohk et al.29 qui ciblent l'internaline A de la protéine membranaire de L. monocytogenes (KD = 103 UFC/mL, 47 bases d'ADN et 15 008 g/mol) ont été obtenus auprès de Gene Link Inc. (Hawthorne, NY). L'extrait de levure, le bouillon de soja trypsique (TSB), l'eau peptonée tamponnée (BPW) et la gélose de soja tryptique (TSA) ont été obtenus auprès de Becton, Dickson and Company (Sparks, MD). Le bouillon de légumes de longue conservation (UHT, traité à ultra-haute température) a été acheté dans une épicerie locale. Le tube de dialyse (DiaEasy™, 3,5 kDa MWCO) a été obtenu auprès de Biovision (Milpitas, CA). Le chlorure de potassium (KCl) et le chlorure de sodium (NaCl) ont été achetés chez EMD Millipore Corporation (Burlington, MA). Le nitrate de potassium (KNO3) a été acquis auprès de British Drug Houses (ON, Canada). Le tampon d'acide tris-éthylènediaminetétraacétique (TE) (pH 7,4) a été obtenu auprès de Quality Biological (Gaithersburg, MD). Le bouillon tryptose phosphate (TPB) a été obtenu auprès de HiMedia (Mumbai, Inde).

Des cultures de bactéries, Listeria monocytogenes (ATCC 15313) et Staphylococcus aureus (ATCC 25923), ont été acquises auprès de l'American Type Culture Collection (Manassas, VA) et utilisées comme bactéries cibles et interférentes pour les tests de sensibilité et de sélectivité, respectivement. Les normes de biosécurité de niveau 2 établies par le National Institute of Health ont été utilisées pour mener des expériences avec des micro-organismes pathogènes S. aureus et L. monocytogenes. Toutes les cultures bactériennes initialement stockées à - 80 ° C ont été transférées dans des milieux de croissance, TPB pour L. monocytogenes et TSB pour S. aureus, par transferts identiques et séquentiels en double et incubées dans des conditions aérobies pendant 24 h à 35 ° CS aureus et les cultures de L. monocytogenes ont été maintenues à 4 ° C pendant 3 mois maximum sur gélose tryptique soja (TSA) et TSA avec extrait de levure à 0, 6% (p / v) (TSAYE) obliques, respectivement. Des transferts obliques vers des milieux de croissance ont été effectués pour préparer les cultures bactériennes à analyser. Les échantillons de bactéries ont été dénombrés en diluant d'abord des échantillons en série dans BPW et en les étalant sur TSA et TSAYE pour S. aureus et L. monocytogenes, respectivement ; après 48 h à 35 °C ; les résultats ont été enregistrés en UFC mL−1.

L'alginate de sodium a été modifié pour incorporer une terminaison de groupe thiol par formation de liaison amide entre les groupes acide carboxylique de l'alginate de sodium et les groupes amino primaires de la cystéine en utilisant un couplage médié par le carbodiimide comme dans Jindal et al.43. Dans cette méthode, les groupes carboxyle de l'alginate sont activés avec de l'EDC à pH 6 pendant 45 min. Ensuite, du chlorhydrate de cystéine monohydraté a été ajouté dans un rapport pondéral de 2: 1 (alginate: cystéine) et laissé réagir pendant 2 h à pH 4 suivi d'une autre 1 h à pH 6 (voir Fig. 1 pour les étapes de fabrication). La réaction a été effectuée sous agitation continue à température ambiante.

Schéma des étapes de fabrication, de biofonctionnalisation et de détection des brosses ALG-thiomère/Pt fonctionnalisées avec un aptamère sélectif de L. monocytogenes. Premièrement, les ALG-thiomères sont formés sur la base de la réaction de l'alginate de sodium avec la cystéine en utilisant la chimie du N-(3-diméthylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide (EDC). Ensuite, l'ALG-thiomère et le platine sont sonoélectrodéposés simultanément sur l'électrode de travail, ce qui donne des brosses ALG-thiomère/Pt qui sont montrées par imagerie SEM. Ensuite, les brosses ALG-thiomère/Pt ont été fonctionnalisées avec de l'aptamère via la chimie de réticulation du carbodiimide. La stratégie de détection consistait en un actionnement de la brosse ALG-thiomère/Pt de l'état effondré à l'état étendu en fonction des changements de pH : la capture des bactéries a été effectuée à pH 7 avec des brosses à l'état étendu, suivie d'une mesure (détection) lorsque les brosses sont effondrées à pH 3.

Ensuite, la solution a été dialysée (seuil de masse moléculaire 3,5 kDa) pour isoler le conjugué alginate-cystéine (ALG-thiomère). La dialyse comprenait deux jours contre du HCl 1 mM (pH 4), suivis d'un jour dans du HCl 1 mM et du NaCl à 1 % (p/v), et de deux autres jours dans du HCl 1 mM (toutes les solutions étaient échangées deux fois par jour). Ensuite, la suspension a été lyophilisée (− 50 °C, − 0,120 mBar, 48 h) dans une unité Labconco FreeZone 6 (Labconco, Kansas City, MO, USA). Les ALG-thiomères ont ensuite été stockés sous atmosphère d'azote à 5 ° C jusqu'à leur utilisation pour la modification du capteur.

Le degré de modification obtenu sur l'alginate a été déterminé en quantifiant la quantité de groupes thiol par l'analyse d'Ellman selon les instructions de Thermo Fisher Scientific44. En bref, les échantillons et l'acide 5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoïque), à ​​savoir le réactif d'Ellman, ont été mélangés dans un tampon phosphate contenant de l'EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) à pH 8 et leur absorbance a été mesurée à 412 nm contre un contrôle à blanc à l'aide d'un spectrophotomètre (Genesys 10S, Thermo Scientific, Waltham, MA). Une courbe standard a été préparée en utilisant du chlorhydrate de cystéine monohydraté pour quantifier la concentration en thiol (exprimée en μmol de groupes thiol g-1).

L'alginate et le platine ont été déposés simultanément (Fig. 1) sur la surface des électrodes de travail en platine/iridium (préalablement polies selon les instructions du fabricant) en utilisant la méthode de sonoélectrodéposition développée par Taguchi et al.19. Dans cette méthode, une alimentation électrique connectait un fil de platine (anode) et l'électrode de travail (cathode) appliquait un potentiel fixe pendant 1 s suivi de 1 s de sonication à la solution de dépôt, en cycles alternés. La solution de dépôt contenait 0,72 % (p/v) d'acide chloroplatinique, 0,001 % (p/v) d'acétate de plomb et ALG-thiomère à différentes concentrations (0,05, 0,075 et 0,1 % p/v). Des tensions de 1,5, 5,75 et 10 V pour 60, 100 et 140 cycles de sonoélectrodéposition ont également été évaluées pour déterminer les conditions de dépôt optimales.

La microscopie électronique à balayage à émission de champ (SEM) a été utilisée pour analyser la morphologie à partir de la meilleure condition de dépôt de brosse basée sur les expériences électrochimiques. Après avoir recouvert l'électrode modifiée avec des brosses ALG-thiomère / Pt d'une couche de platine de 5 nm d'épaisseur [Cressington sputter coater 208 HR (Watford, Royaume-Uni)], des images SEM ont été prises par un FEI Quanta 600 FEG (Hillsboro, OR). Un grossissement de 10 000 et 16 000 fois avec une tension d'accélération de 10 kV a été utilisé pour l'imagerie de surface.

La chimie de surface des électrodes revêtues à l'aide du dépôt de brosse optimisé sélectionné a été analysée par spectroscopie photoélectronique à rayons X (XPS), réalisée dans un Omicron ESCA + (Scienta Omicron, Suède) avec un canon à électrons CN10 et un canon à rayons X double Mg/Al.

Chaque étape de la préparation du biocapteur (dépôt d'alginate-platine, chargement d'aptamère et détection de bactéries) a été caractérisée électrochimiquement à l'aide d'un système cellulaire à 3 électrodes (électrodes de travail, de référence Ag/AgCl et auxiliaires en platine) à température ambiante en utilisant les méthodes de voltamétrie cyclique (CV) et/ou de spectroscopie d'impédance électrochimique (EIS) décrites par Burrs et al.17 en utilisant un potentiostat/analyseur d'impédance CHI 600E. Le test CV a été effectué dans une solution de Fe(CN)63- 4 mM dans une solution de KNO3 1 mM avec des vitesses de balayage de 50, 100, 150 et 200 mV/s, un potentiel de commutation de 650 mV et un temps de repos de 10 s. CV a été utilisé pour obtenir la surface électroactive (ESA en cm2) des électrodes via la théorie de Randles-Sevcik en utilisant la pente du courant par rapport à la racine carrée de la vitesse de balayage (ip par rapport à v1/2), comme indiqué précédemment19,45 (voir les informations complémentaires pour plus de détails). Les valeurs ESA ont été utilisées pour déterminer les meilleurs paramètres de dépôt (concentration d'ALG-thiomère, tension et nombre de cycles de sonoélectrodéposition, comme décrit dans ALG-Thiomer/Platinum nanobrsuh deposition), ainsi que pour caractériser l'actionnement de la brosse et pour déterminer la concentration de chargement d'aptamère (voir les informations complémentaires pour plus de détails).

Pour les tests d'actionnement, une sonde chargée négativement (KFeCN63−), une sonde neutre (C6H4(OH)2) et une sonde chargée positivement Ru(NH3)63+ ont été utilisées. Le pH de la solution de sonde redox a été ajusté à pH 7 ou pH 3 en utilisant une solution de HCl ou de NaOH 1 M. Le pH de la solution redox a été surveillé pendant les tests CV pour s'assurer que le pH rapporté ne changeait pas de plus de 0,5 unité de pH. Des tests d'actionnement ont également été effectués en présence d'une concentration de fond constante de Listeria de 103 UFC mL-1 dans une solution saline tampon phosphate (PBS) en utilisant EIS pour déterminer la stratégie de capture et de mesure la plus efficace entre la conformation étendue et effondrée des brosses.

L'EIS a été utilisé pour déterminer la limite de détection (LOD), la plage de détection et la sensibilité du biocapteur lorsqu'il est exposé à des bactéries à des concentrations variant de 101 à 106 UFC mL-1 (courbe standard). Pour la procédure de fonctionnalisation des brosses ALG-thiomère/Pt avec des aptamères, voir les informations complémentaires pour plus de détails. L'analyse a été effectuée avec un potentiel CC initial de 0 V, une amplitude CA de 100 mV et une plage de fréquences de 1 à 100 000 Hz. Les tests de sensibilité ont d'abord été effectués dans du PBS, puis à nouveau dans du bouillon de légumes commercialement stérile. À partir des tracés de Bode (impédance en fonction de la fréquence), la valeur d'impédance à fréquence de coupure fixe a été utilisée pour construire les courbes d'étalonnage, constituées de l'impédance (Ohm) en fonction de la concentration de cellules (log UFC mL-1). A partir des courbes d'étalonnage (R2 > 0,97), la sensibilité à la bactérie cible a été obtenue en utilisant la pente de la portion linéaire puis la méthode 3σ a été utilisée pour calculer la limite de détection (LOD)39. Le changement d'impédance (\(\mathrm{\Delta Z}= {Z}_{bactérie}-{Z}_{non \, bactérie}\)) a été utilisé pour illustrer les performances des électrodes indépendamment du support. La sélectivité vis-à-vis de L. monocytogenes a été évaluée en déterminant la sensibilité et la LOD en présence d'une concentration identique d'une autre bactérie Gram-positive (S. aureus) dans du PBS et dans un bouillon de légumes stérile.

Les résultats d'expériences indépendantes ont été réalisés au moins en triple et exprimés en moyenne ± écart type. Le logiciel SPSS a été utilisé pour effectuer l'analyse statistique. L'ANOVA (analyse de variance unidirectionnelle) a été utilisée pour tester la signification et exprimée au niveau p <0,05. Des moyennes significativement différentes ont été séparées par le test de Tukey.

L'efficacité de la réaction ALG-thiomère a d'abord été évaluée par l'analyse d'Ellman. Le résultat obtenu était de 1050 ± 200 μmol de groupes thiol g-1 de polymère, environ 3 fois plus élevé que la teneur en thiol de 324,54 μmol g-1 présentée par Jindal et al.43 avec une procédure similaire. Dans notre approche, l'EDC (un composé carbodiimide) réagit avec les groupes acide carboxylique de l'alginate pour former un intermédiaire O-acylisourée actif qui est remplacé par les groupes amino primaires de la cystéine, formant une liaison amide avec le groupe carboxyle d'origine (voir Fig. 1). Le N-hydroxysuccinimide (NHS) peut être inclus dans la réaction pour améliorer l'efficacité car l'EDC couple le NHS aux carboxyles formant un ester NHS qui est considérablement plus stable que l'intermédiaire O-acylisourée46. Marcano et Sabino47 ont rapporté une valeur plus élevée de 1939 μmol g−1 de groupes thiol en incluant NHS sur la réaction d'activation avec EDC. Cependant, cette approche introduit des groupes fonctionnels supplémentaires qui peuvent se réticuler, réduisant la capacité de contrôler l'actionnement de la brosse et introduisant une erreur expérimentale.

La présence du groupe thiol dans l'analyse d'Ellman indique que le soufre est présent dans l'échantillon mais ne fournit pas d'informations sur l'état du soufre (groupe sulfhydryle réactif ou oxydé) car le groupe thiol est très sensible à l'oxydation lors de l'exposition à l'oxygène atmosphérique avec formation possible de liaison de type disulfure ou de réticulation (–S–S–)47.

Une analyse XPS a été effectuée pour caractériser les liaisons chimiques pour la meilleure condition de dépôt liée à la réponse électrochimique (voir les informations complémentaires pour les résultats détaillés et la discussion). Le spectre XPS du dépôt au pinceau ALG-thiomère / Pt (Fig. 2a) montre le dépôt efficace des composants ALG-thiomère et Pt, avec des pics caractéristiques de C 1s, O 1s, N 1s et S 2p d'ALG-thiomère et Pt 4f de platine. Le pic de N 1s à 399 eV se situe dans la plage des complexes cystéine-métal48. L'énergie de liaison de 400 eV peut être associée à la présence de groupement amine40 ou à la cystéine49. De même, Wang et al.50 et Li et al.51 ont présenté de petits pics S 2p et N 1s sur la même plage que dans le présent travail, indiquant la présence de ces composants sur des points de carbone (complexes citrate trisodique-cystéine en comparant son spectre complet XPS avec de la cystéine pure) et une monocouche auto-assemblée d'alcanethiol sur Pt métallique, respectivement. L'énergie de liaison S 2p de 164 eV (Fig. 2b) est caractéristique du thiol52 ou de sa coordination avec les ions métalliques48. Le pic à 162,5 eV (S 2p) se situe également dans la plage attendue pour les liaisons métal-soufre52. Yang et Agrios53 ont associé un doublet dans la région S 2p d'un acide 4-mercaptobenzoïque modifié au Pt à des valeurs légèrement inférieures (161,84 eV et 163,04 eV) à celles obtenues dans le présent travail (162,5 eV et 164 eV) à la formation d'une liaison Pt–S. Castner et al.54 ont également rapporté l'énergie de liaison de 161,9 eV comme étant cohérente avec les atomes de soufre liés à la surface de l'or en tant qu'espèce de thiolate. Le pic S 2p au voisinage de 168,5 eV pourrait être dû à la présence de soufre oxydé48,53. Le spectre Pt 4f (Fig. 2c) présente deux pics à 71 eV et 74,3 eV correspondant au Pt lié au S, ce qui est cohérent avec les rapports de la littérature pour le Pt en contact avec les atomes de S 53,55. Romanchenko et al.56 ont attribué l'énergie de liaison de 71,5 eV aux nanoparticules métalliques PT0 et 74 eV aux composés PT (IV) -S, qui pourraient également être le cas dans la présente étude comme: (1) PT pourrait être déposée directement sur la surface de l'électrode ainsi que la liaison à l'alg-thiomère avant de déposer et (2) à la pnetiv. ) Cations et sa réduction de PT057. Dans l'ensemble, les spectres XPS illustrés à la figure 2 indiquent une liaison entre les nanoparticules de Pt et les atomes de S dans l'ALG-thiomère.

Analyse par spectroscopie photoélectronique à rayons X (XPS). (a) spectre d'enquête, (b) spectre S 2p et (c) spectre Pt 4f montrant le co-dépôt réussi à la fois d'ALG-thiomère et de Pt sur les électrodes. Les lignes pleines avec des courbes lisses proviennent du logiciel XPS Peak utilisé pour identifier les pics S 2p et Pt 4f.

La morphologie des brosses de nanoplatine et d'alginate pour la meilleure condition de dépôt liée à la réponse électrochimique (voir les détails dans les résultats d'information à l'appui et la discussion) est illustrée à la Fig. 3. Le dépôt de brosse ALG-thiomère/Pt a formé des sphéroïdes juxtaposés (nœuds terminaux de brosse) avec des diamètres allant de 80 à 400 nm avec un revêtement uniforme avec des structures aléatoires en forme de chou-fleur réparties sur toute la surface. Une structure similaire, bien que plus lisse, a été présentée par Chen et al.42 lors du dépôt électrolytique simultané d'alginate et de composite MnO2-C. De plus, une structure sphéroïde similaire bien que plus poreuse et tridimensionnelle a été montrée par Giacobassi et al.39 avec le dépôt de brosses PNIPAAm sur des couches réduites d'oxyde de graphène et de platine. De manière similaire aux brosses PNIPAAm décrites par Giacobassi et al.39, l'électrodéposition des brosses ALG-thiomère/Pt a conduit à une formation de brosse homogène avec une distribution uniforme de la taille des tiges et des nœuds. Selon Taguchi et al.19, la méthode de sonoélectrodéposition pulsée favorise un transfert de masse accru à la surface de l'électrode, ce qui se traduit par un dépôt de matériau uniforme. Les structures relativement grandes et lisses obtenues dans le présent travail sont attendues puisque le complexe ALG-thiomère co-déposé est un matériau polymère significativement grand, ce qui a également été observé par Giacobassi et al.39. La forme des sphéroïdes augmente la surface, ce qui entraîne une augmentation significative de la surface électrochimique par rapport à l'électrode nue (voir les résultats et la discussion dans les informations complémentaires). De plus, la configuration de la brosse en combinaison avec l'actionnement de la brosse devrait entraîner une exposition accrue des aptamères au milieu et à la liaison bactérienne ultérieure, comme indiqué précédemment par Giacobassi et al.39 et Hills et al.30 (voir les résultats Sections "ALG-thiomer/Pt brush actuation and Listeria spp. Capture" et "Biosensor performance testing"). Une enquête plus approfondie sur les effets des différents paramètres de dépôt sur la morphologie doit être effectuée compte tenu de l'importance de la morphologie pour la détection des performances.

Images de microscopie électronique à balayage de la brosse ALG-thiomère/Pt à 10 kV et (a) 10 000 et (b) grossissement 16 100 fois, respectivement, montrant une formation et un dépôt uniformes de la brosse sur la surface de l'électrode avec des nœuds terminaux allant de 80 à 400 nm de diamètre.

L'alginate est un polymère acide qui a une valeur de pKa comprise entre 3,2 et 4 (pour les acides guluronique et mannuronique, respectivement)37,58. Normalement, en dessous du pKa de l'alginate, les groupes acides carboxyliques sont protonisés sous la forme COOH et le polymère est effondré. Au fur et à mesure que le pH de la solution augmente, le COOH devient ionisé en COO−, et la répulsion électrostatique résultante parmi ces groupes provoque l'extension du polymère37,59,60. Pour tester si la propriété d'actionnement des stimuli pH de l'alginate était affectée par sa modification et pour caractériser les interactions électrostatiques lors de l'actionnement à la surface de l'électrode, des tests CV ont été effectués avec trois sondes redox différentes et les valeurs ESA ont été calculées (Fig. 4a). Une sonde chargée négativement (KFeCN63−), une sonde neutre (C6H4(OH)2) et une sonde chargée positivement Ru(NH3)63+ ont été utilisées. De plus, CV a été réalisée à pH de 3 et 7, respectivement en dessous et au-dessus du pKa du polymère (Fig. 4a), pendant trois cycles répétitifs.

(a) Interactions électrostatiques pendant trois cycles d'actionnement entre pH 3 et pH 7 des brosses ALG-thiomère/Pt avec différentes sondes redox : une sonde chargée positivement (Ru(NH3)63+, une sonde chargée négativement (KFeCN63−) et une sonde neutre (C6H4(OH)2). (b) Impédance totale moyenne pour la brosse ALG-thiomère/Pt fonctionnalisée avec 400 nM d'aptamère et exposée à 103 C FU mL-1 de Listeria monocytogenes à différentes fréquences de coupure pour diverses stratégies de capture / mesure basées sur l'actionnement "EX" se réfère à l'état étendu (pH 7), "COL" se réfère à l'état de la brosse effondrée (pH 3), "cap" se réfère à la capture cellulaire et "meas" se réfère à la mesure. Les barres d'erreur indiquent l'écart type de la moyenne arithmétique d'au moins trois répétitions; différentes lettres représentent des moyennes significativement différentes (p <0,05).

Comme le montre la figure 4a, au-dessus du pKa (pH 7), le transport d'électrons diminue avec la sonde KFeCN63− en raison de la répulsion de charge/de l'encombrement stérique lorsque le groupe alginate carboxylate est chargé négativement ; avec la sonde neutre (C6H4(OH)2), le transfert d'électrons est moins affecté mais un gonflement peut néanmoins se produire en raison de la répulsion électrostatique intramoléculaire entre les groupes carboxylate (COO−) de l'alginate59 ; et avec la sonde Ru(NH3)63+, le courant de crête et l'ESA augmentent en raison des interactions électrostatiques. L'inverse se produit en dessous du pKa (pH 3), le transfert d'électrons est favorisé avec la sonde négative augmentant le courant de crête et l'ESA, tandis que le courant de crête et l'ESA diminuent avec la sonde positive. Un comportement similaire d'ESA augmentant ou réduisant en raison d'interactions électrostatiques ou de répulsion, respectivement, a également été observé par Oliveira et al.31 et Hills et al.30 pour l'activation du chitosane avec les mêmes sondes redox. Avec un actionnement répétitif, le courant de crête et l'ESA ont légèrement changé (Fig. 4a) entre les répétitions ; cependant, le pourcentage de changement n'était pas significatif sans hystérésis observable, ce qui indique que l'actionnement de la brosse ALG-thiomère/Pt est réversible et peut être répété plusieurs fois (au moins 3 fois) de l'état effondré à l'état étendu. Ces résultats sont une amélioration par rapport à Hills et al.30 et Giacobassi et al.39 de l'actionnement de la brosse de chitosan et de PNIPAAm, respectivement, qui ont rapporté une hystérésis d'actionnement entre les répétitions.

La brosse ALG-thiomère / Pt a été convertie en un aptacapteur en fonctionnalisant avec 400 nM d'aptamère à terminaison amino via une réticulation au carbodiimide, comme indiqué sur la figure 1 (voir les informations complémentaires pour plus de détails). Basé sur le principe que la liaison des bactéries cibles à l'aptamère diminue le transfert d'électrons à la surface de l'électrode, qui est mesuré comme une augmentation de l'impédance, des tests d'actionnement ont été effectués avec EIS pour déterminer les valeurs de pH optimales pour capturer et détecter L. monocytogenes. Pour ces expériences, une concentration constante de L. monocytogenes de 103 UFC mL-1 dans du PBS a été utilisée. Sur la figure 4b, la conformation de brosse étendue à pH > 3,5 est notée (EX), la conformation de brosse effondrée à pH < 3,5 est notée (COL), l'état de capture cellulaire est noté par (cap) et l'étape de mesure électrochimique est notée par (meas). La capture cellulaire dans la conformation étendue (pH 7) et la détection à l'état effondré (pH 3) ont fourni les valeurs d'impédance les plus élevées (p <0, 05) pour toutes les fréquences de coupure et, par conséquent, l'efficacité de détection (voir également les diagrammes de Bode sur la Fig. S3 dans les informations complémentaires). La capture optimale des bactéries ciblées à la forme étendue peut être liée à une zone de contact plus élevée avec la solution testée et à une probabilité accrue d'interaction aptamère-cellule, par rapport au pH 3 auquel les brosses sont contractées, et le ou les sites de liaison au récepteur peuvent être inaccessibles. Semblable à nos travaux antérieurs sur cette stratégie de capture, il est probable que les cellules s'emmêlent dans la matrice polymère au cours de l'étape de détection, où la liaison aptamère-cible peut ne plus être le mécanisme de capture cellulaire mais plutôt l'enchevêtrement lors de l'effondrement de la nanobrosse. La spécificité de cette plate-forme de détection est enracinée dans l'affinité initiale entre l'aptamère et la cible à pH 7 (nanobrosse ALG-thiomère étendue), où l'effondrement à pH 3 provoque probablement des changements de structure secondaire dans l'aptamère mais emprisonne également les cellules dans la matrice polymère.

Cette découverte sur la stratégie de capture est cohérente avec les résultats rapportés par Hills et al.30 et Giacobassi et al.39 qui ont également présenté une efficacité de détection plus élevée en utilisant la stratégie EX/cap → COL/meas pour la détection des agents pathogènes. De plus, la modification de l'alginate avec de la cystéine suivie de la fixation de l'aptamère, en utilisant ses groupes carbonyle, semble neutraliser les charges négatives de l'alginate qui provoqueraient normalement une répulsion électrostatique vers la membrane fortement chargée négativement (dans la plupart des conditions) de L. monocytogenes61. Cette méthode de capture de bactéries est assez simple par rapport à d'autres rapportées dans la littérature comme la méthode de Malic et al.62 qui a développé un dispositif de séparation magnétique à haut gradient adapté aux nanoparticules immunomagnétiques basé sur un piège magnétique 3D intégré dans un dispositif microfluidique polymère pour la capture magnétique et la libération de L. monocytogenes.

Les propriétés diélectriques des tissus biologiques sont caractérisées par trois dispersions comprenant : (a) la dispersion α se produisant à basse fréquence, associée aux interfaces tissulaires, telles que les membranes ; (b) β-dispersion à radiofréquence, causée par la polarisation des membranes cellulaires, des protéines et d'autres macromolécules organiques; et (c) dispersion γ à fréquence micro-onde, associée à la polarisation des molécules d'eau. Les membranes cellulaires agissent comme des barrières isolantes à basses fréquences démontrant des voies résistives, tout en démontrant une capacité élevée à des fréquences plus élevées. Par conséquent, les données d'actionnement de l'EIS ont été utilisées pour déterminer la fréquence de coupure (CF). Cette analyse a été réalisée dans une gamme de fréquence de 1 à 50 Hz, qui correspond à la région de dispersion de fréquence alpha des tissus biologiques. Le signal d'impédance maximale (p <0, 05) a été observé à CF de 1 Hz (Fig. 4b) et a été sélectionné pour déterminer les indicateurs de performance clés (KPI) de l'aptacapteur dans les milieux complexes et les mélanges de bactéries dans la section suivante.

La capacité des électrodes déposées avec des brosses ALG-thiomère/Pt fonctionnalisées avec 400 nM d'aptamère à terminaison amino pour détecter L. monocytogenes a été évaluée par EIS. Voir les informations complémentaires pour plus de détails sur la fonctionnalisation du biocapteur et les résultats sur la concentration optimale de chargement d'aptamère sur les brosses ALG-thiomère / Pt (Fig. S2). Dans le domaine des biocapteurs, l'EIS est particulièrement pratique pour la détection d'événements de liaison sur la surface du transducteur sans avoir besoin de marqueurs (tels que des colorants fluorescents, des enzymes, des composés redox ou radioactifs)63. Le terme impédimétrique apparaît parce que l'interface offre (lors de l'occupation des centres récepteurs) un obstacle électrique pour les charges à transférer qui augmente en fonction de la liaison de la cible à l'interface, ce qui permet la biodétection sans marqueur64. Les différences d'impédance causées par la présence de bactéries (allant de 100 à 103 UFC mL−1) ont été obtenues en utilisant la stratégie EX/cap → COL/meas (pH 7 → 3). La durée totale du test était de 17 min, dont 15 min pour la capture des bactéries et 2 min pour la mesure EIS. Les tracés de Bode sont affichés sur une plage de fréquences de 1 Hz à 100 kHz ; les encarts sont une vue agrandie de la plage de fréquences inférieures (1–5 Hz). Sur la base de l'analyse de la fréquence de coupure (CF) présentée à la Fig. 4b, toutes les courbes d'étalonnage ont été développées à l'aide des données des tracés de Bode pour un CF de 1 Hz.

La figure 5 montre une électrode nanohybride ALG-thiomère/Pt/aptamère calibrée pour L. monocytogenes (y = 39,21x + 631,64, R2 = 0,99) et en présence de S. aureus (y = 69,34x + 719,16, R2 = 0,98). Le test de sélectivité a été réalisé avec Staphylococcus aureus en raison de sa similitude avec Listeria en tant que bactérie à Gram positif et du fait que les deux sont des agents pathogènes d'origine alimentaire connus en plus d'avoir des tailles similaires (0,5 à 2 µm). L'ajout d'une concentration égale de S. aureus dans la solution de test n'a pas montré d'interférence significative (p > 0,05) sur la LOD (4,5 ± 0,8 UFC mL-1 avec L. monocytogenes seul et 5,7 ± 2,1 UFC mL-1 avec les deux bactéries) indiquant l'absence de réaction croisée entre le capteur et S. aureus. La sensibilité a augmenté (p < 0,05) de 39,21 ± 2,61 Ω/log (CFU mL−1) avec L. monocytogenes seul à 69,34 ± 2,79 Ω/log (CFU mL−1) lorsque S. aureus était également présent. La plage linéaire a également changé de 101 à 106 UFC mL-1 avec uniquement L. monocytogenes dans du PBS à 101–105 UFC mL-1 dans le mélange de bactéries. Ohk et al.29 ont présenté une LOD de 103 UFC mL−1 en utilisant le même aptamère dans un biocapteur à fibre optique pour détecter Listeria spp. Récemment, Oliveira et al.31 utilisant le même aptamère ont présenté des LOD similaires par rapport à l'étude actuelle pour L. monocytogenes seul dans du PBS et en présence de S. aureus, 2,5 et 2,6 UFC mL−1, respectivement ; en actionnant des brosses en chitosane/platine. Alors que les capteurs d'anticorps sont susceptibles de donner des réactions faussement positives avec S. aureus, qui est également un porteur de la protéine A, l'aptamère utilisé dans le présent travail s'est avéré sélectif vis-à-vis de L. monocytogenes29. Cet aptamère cible la protéine de surface Internaline A qui est l'une des principales protéines d'invasion impliquées dans la pathogenèse29. Malgré le fait que cette protéine soit structurellement analogue à certaines protéines de la paroi cellulaire avec des répétitions internes identifiées chez les membres des genres Staphylococcus et Streptococcus65, les présents résultats corroborent que cet aptamère peut être sélectif vis-à-vis de L. monocytogenes.

Parcelles représentatives de Bode sur la plage de fréquences de 1 à 100 000 Hz (les encarts sont agrandis compte tenu de la plage de fréquences inférieure de 1 à 5 Hz) pour le capteur de brosse ALG-thiomère/Pt fonctionnalisé avec un aptamère de 400 nM exposé à (a) L. monocytogenes dans du PBS et (b) L. monocytogenes + S. aureus dans du PBS. ( c ) Courbes d'étalonnage (changement d'impédance total à 1 Hz par rapport à la concentration de bactéries log). Les barres d'erreur représentent l'écart type de la moyenne arithmétique d'au moins trois répétitions.

Après avoir confirmé la capacité du capteur ALG-thiomer/Pt brush sensor à détecter les bactéries dans le PBS, les capteurs ont été testés dans un produit alimentaire pour déterminer sa sélectivité vis-à-vis des bactéries cibles ainsi que si la sensibilité peut être affectée par l'interférence des composants alimentaires. Le bouillon de poulet (Fig. 6, y = 42,59x + 1320,93, R2 = 0,98) a été utilisé car il contient des glucides et des protéines, entre autres composants, qui pourraient interagir avec le biocapteur par adsorption non spécifique entraînant un signal faux positif. La sensibilité envers L. monocytogenes dans le bouillon de poulet était de 42,59 ± 2,35 Ω/log(CFU mL−1) avec LOD de 4,4 ± 0,8 UFC mL−1, tous deux similaires (p > 0,05) aux résultats dans le PBS. Ces résultats indiquent également que l'aptamère est capable de se lier sélectivement à L. monocytogenes même dans des matrices alimentaires complexes. En utilisant le même aptamère, Hills et al.30 ont rapporté une limite de détection légèrement plus élevée de 9,1 UFC mL-1 dans un bouillon de légumes avec une électrode à brosse couche par couche réduite en oxyde de graphène/nanoplatine/chitosan qui s'activait en fonction de la réponse au pH du chitosan.

( a ) Diagramme de Bode représentatif sur la plage de fréquences de 1 à 100 000 Hz (les encarts sont agrandis compte tenu de la plage de fréquences inférieure de 1 à 5 Hz) et ( b ) courbe d'étalonnage (changement d'impédance total à 1 Hz par rapport à la concentration de bactéries log) pour le capteur de brosse ALG-thiomère / Pt fonctionnalisé avec un aptamère 400 nM exposé à L. monocytogenes dans du bouillon de poulet. Les barres d'erreur représentent l'écart type de la moyenne arithmétique d'au moins trois répétitions.

L'efficacité de liaison de l'aptamère et son rôle sur les performances du biocapteur ont été évalués en exposant le capteur de brosse ALG-thiomère / Pt absent d'aptamères à des concentrations croissantes de L. monocytogenes dans du PBS (voir informations complémentaires, Fig. S4). La LOD obtenue était de 28,88 ± 1,31 UFC mL−1 avec une sensibilité de 23,27 ± 7,87 Ω/log(UFC mL−1), respectivement. Les performances du capteur avec aptamère présenté précédemment étaient significativement (p < 0,05) meilleures par rapport à celui sans aptamère. Malgré un certain piégeage aléatoire de bactéries sur les nanobrosses, ces résultats de LOD et de sensibilité démontrent le rôle de l'aptamère de se lier sélectivement à L. monocytogenes et d'améliorer considérablement les performances du capteur. En outre, ces résultats démontrent davantage l'efficacité du protocole d'actionnement pour capturer les bactéries en appliquant les brosses ALG-thiomer/Pt, qui pourraient être utilisées comme première étape pour la surveillance de la sécurité alimentaire (c'est-à-dire le nombre total de bactéries).

L'alginate devient de plus en plus populaire pour les applications de biocapteurs en raison de sa biocompatibilité et de ses groupes fonctionnels utiles pour l'encapsulation et l'immobilisation d'agents de bioreconnaissance tels que la détection d'antibiotiques, de cellules tumorales, d'analyses sanguines, entre autres66,67. Certains ont utilisé des bactéries encapsulées pour surveiller la toxicité de l'eau68,69, mais encore moins de rapports impliquent la détection de bactéries. Par exemple, Kikuchi et al.70, ont utilisé de l'alginate pour encapsuler un colorant qui est clivé par l'enzyme b-galactosidase d'E. coli pour sa détection dans le lait maternel, rapportant une LOD de 102 UFC mL-1 après 2 à 8 h d'incubation.

Une compilation des biocapteurs actuels pour la détection de L. monocytogenes dans différents échantillons alimentaires ou tampons est présentée dans le tableau S1 (voir informations complémentaires). Liu et al.71 ont présenté de bons résultats en détectant L. monocytogenes dans une plage de 68 à 68 × 106 UFC mL-1 en utilisant ensemble des nanoparticules magnétiques fonctionnalisées par aptamère (comme sondes de préconcentration) et des nanoparticules de conversion ascendante fonctionnalisées par aptamère (sondes de signal fluorescentes) ; cependant, la procédure comprend une incubation de 1 h plus une étape de pré-concentration. Sidhu et al.72 ont proposé un ensemble de microélectrodes interdigitées en platine fonctionnalisées avec le même aptamère utilisé dans le présent travail et ont rapporté une LOD de 5,39 UFC mL−1 de Listeria spp. dans du PBS également avec une détection de 17 min. Dans un autre travail, Sidhu et al.32 ont appliqué les mêmes microélectrodes à réseau interdigité en platine fonctionnalisées avec des aptamères pour un écoulement rapide sur site grâce à la détection de Listeria spp. dans l'eau d'irrigation à l'aide d'un potentiostat basé sur un smartphone et dans des conditions de débit et la LOD rapportée était de 48 UFC mL-1. Notre capteur offre certains avantages par rapport à la plupart trouvés dans la littérature, y compris une fabrication plus simple et plus rapide sans avoir besoin de fabrication en salle blanche ; aucun étiquetage ni pré-concentration de bactéries requis ; et un temps de détection court, étant l'une des plates-formes les plus efficaces pour la détection de L. monocytogenes à ce jour, avec une faible limite de détection et une large plage de détection linéaire pertinente pour la sécurité alimentaire.

La détection d'un agent pathogène spécifique dans n'importe quel échantillon d'aliment réel prend du temps et est laborieuse, car il existe des signaux de fond dus aux impuretés dans l'échantillon, soit à partir des structures complexes à plusieurs composants, soit à la présence d'autres micro-organismes (pathogènes et non pathogènes) qui nécessitent des traitements de pré-enrichissement et des paramètres de laboratoire. Cette étude rend compte d'aptasensors impédimétriques sensibles, sélectifs et simples à fabriquer à l'aide d'un processus de fabrication en une étape de nanobrosses d'alginate thiomère/platine. Pour la première fois, nous montrons que l'ALG-thiomère modifié avec du nanoplatine et des aptamères maintient les propriétés de réponse aux stimuli de l'alginate tout en maintenant l'affinité pour les bactéries cibles, L. monocytogenes, en raison de la liaison à l'aptamère. L'actionnement des brosses ALG-thiomère/Pt a considérablement amélioré la détection des bactéries en raison du piégeage de la matrice à l'état effondré. La plage de détection linéaire entre 10 et 106 UFC mL-1 et la limite de détection de 5 UFC mL-1 dans un échantillon alimentaire couvrent les niveaux pertinents pour l'analyse de la sécurité alimentaire, permettant aux fabricants de produits alimentaires de réduire les implications économiques et de santé publique des rappels d'aliments contaminés. Comparé à d'autres méthodes disponibles dans la littérature, ce capteur est parmi les mécanismes de capture les plus efficaces pour L. monocytogenes, en plus d'autres avantages tels que la fabrication simple en une étape, et aucun étiquetage, aucune pré-incubation ni concentration requise et un temps de réponse de 17 min. Les résultats présentés dans cette étude démontrent que la plate-forme de capteurs développée convient à son utilisation dans les applications de surveillance de la sécurité alimentaire. De plus, cette plate-forme ALG-thiomère peut être testée plus avant pour la détection d'autres agents pathogènes d'origine alimentaire ou la détection de petites molécules, ce qui améliore considérablement la détection de cibles dans des matrices complexes.

Les données présentées dans cette étude sont disponibles sur demande auprès des auteurs correspondants.

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Département de génie biologique et agricole, Texas A&M University, College Station, TX, 77843, États-Unis

Daniela A. Oliveira

Sciences agricoles, Université Clemson, Clemson, SC, 29631, États-Unis

Eric S. McLamore

Département de génie mécanique, Iowa State University, Ames, IA, 50011, États-Unis

Carmen L. Gomes

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Le manuscrit a été rédigé grâce aux contributions de tous les auteurs. Tous les auteurs ont donné leur approbation à la version finale du manuscrit. Conceptualisation, ESM et CLG ; méthodologie, DAO, ESM et CLG ; validation, DAO, CLG ; analyse formelle, DAO, ESM et CLG ; ressources, ESM et CLG ; curation des données, DAO, ESM et CLG ; écriture-préparation du projet original, DAO ; rédaction-révision et édition, DAO, ESM et CLG ; visualisation, DAO, ESM et CLG ; supervision, ESM et CLG ; acquisition de financement, ESM et CLG

Correspondance à Carmen L. Gomes.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Oliveira, DA, McLamore, ES & Gomes, CL Détection rapide et sans étiquette de Listeria monocytogenes basée sur des nanobrosses alginate-platine thiomère sensibles aux stimuli. Sci Rep 12, 21413 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25753-7

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Reçu : 13 mai 2022

Accepté : 05 décembre 2022

Publié: 10 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-25753-7

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