Les membranes intracytoplasmiques se développent chez Geobacter sulfurreducens dans des conditions thermodynamiquement limitantes

npj Biofilms et Microbiomes volume 9, Numéro d'article : 18 (2023) Citer cet article

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Geobacter sulfurreducens est une bactérie électroactive capable de réduire les oxydes métalliques dans l'environnement et les électrodes dans les systèmes d'ingénierie1,2. Geobacter sp. sont les organismes clés des biofilms électrogéniques, car leur respiration consomme les produits de fermentation produits par d'autres organismes et réduit un accepteur d'électrons terminal, par exemple l'oxyde de fer ou une électrode. Pour respirer les accepteurs d'électrons extracellulaires avec une large gamme de potentiels redox, G. sulfurreducens possède un réseau complexe de protéines respiratoires, dont beaucoup sont liées à la membrane3,4,5. Nous avons identifié des structures de membrane intracytoplasmique (ICM) chez G. sulfurreducens. Cette MCI est une invagination de la membrane interne qui s'est pliée et organisée par un mécanisme inconnu, souvent mais pas toujours située près de l'extrémité d'une cellule. En utilisant la microscopie confocale, nous pouvons identifier qu'au moins la moitié des cellules contiennent un ICM lorsqu'elles sont cultivées sur des surfaces d'anode à faible potentiel, tandis que les cellules cultivées sur des surfaces d'anode à potentiel plus élevé ou en utilisant du fumarate comme accepteur d'électrons avaient une fréquence ICM significativement plus faible. Les modèles 3D développés à partir de tomographies cryo-électroniques montrent que l'ICM est une extension continue de la membrane interne en contact avec l'espace cytoplasmique et périplasmique. L'abondance différentielle de l'ICM dans les cellules cultivées dans différentes conditions thermodynamiques soutient l'hypothèse selon laquelle il s'agit d'une adaptation à une disponibilité énergétique limitée, car une augmentation des protéines respiratoires liées à la membrane pourrait augmenter le flux d'électrons. Ainsi, l'ICM fournit une surface de membrane interne supplémentaire pour augmenter l'abondance de ces protéines. G. sulfurreducens est le premier thermodesulfobactérie ou réducteur d'oxyde métallique trouvé pour produire des ICM.

Alors que l'on différencie classiquement les procaryotes des eucaryotes par une différence de compartimentation organite du cytoplasme, la réalité est plus compliquée. Les procaryotes avec une grande variété de métabolismes et de niches écologiques expriment divers organites intracellulaires bien définis6,7,8. La plupart des organites qui ont été caractérisés chez les procaryotes appartiennent à l'une des deux catégories. Les premiers sont des compartiments isolés où des conditions spécialisées sont maintenues pour effectuer des processus chimiques impossibles dans l'espace cytoplasmique, par exemple l'anammoxosome9, le carboxysome10 et l'acidocalcisome11. La deuxième catégorie d'organites procaryotes se compose de structures membranaires densément emballées qui facilitent un débit plus élevé pour les processus métaboliques dépendant de la membrane en augmentant la surface disponible dans une cellule, par exemple le thylakoïde, le chlorosome12 et les structures membraneuses dans les oxydants de méthane, de nitrite et d'ammoniac13,14,15,16. Nous utilisons le terme général de «membrane intracytoplasmique» (ICM) pour décrire toutes ces structures lipidiques chez les procaryotes car il comprend des organites avec des structures membraneuses aux fonctions inconnues. Pour les organismes fonctionnant avec des marges thermodynamiques minces ou effectuant des réactions chimiques lentes, le taux d'activité enzymatique, par exemple la production d'ATP, doit être proportionnel à la surface de membrane disponible pour ces enzymes. Dans certaines bactéries oxydant le méthane, par exemple, deux enzymes métaboliques essentielles - la méthane monooxygénase et la méthanol déshydrogénase - ont été trouvées dans l'ICM, fournissant hypothétiquement un débit plus élevé pour une réaction potentiellement limitante14,17, et la même chose a été observée avec l'ammoniac monooxygénase dans les bactéries oxydant l'ammoniac15. Fait intéressant, la relation entre les protéines membranaires et les ICM va dans les deux sens, car la modification d'une bactérie pour surexprimer une enzyme liée à la membrane peut stimuler des structures de type ICM dans une bactérie qui manque normalement d'organites18,19.

Geobacter sulfurreducens est une thermodesulfobactérie à Gram négatif (précédemment classée comme δ-protéobactérie) qui réduit le fer et d'autres métaux dans des environnements anaérobies1. En tant qu'organisme adapté pour respirer les oxydes métalliques insolubles dans la nature, G. sulfurreducens est également capable de respirer les accepteurs d'électrons solides artificiels2. Dans un système d'ingénierie, nous pouvons tirer parti de ce transfert d'électrons extracellulaire (EET) pour produire un courant électrique mesurable. Le séquençage des amplicons des biofilms électroactifs révèle généralement que l'espèce Geobacter est l'organisme le plus abondant, quelle que soit la source d'inoculum20. G. sulfurreducens réduit les accepteurs d'électrons avec une large gamme de potentiels redox estimés21,22 (−0,17 [goethite] à +0,98 V vs SHE [palladium]), produit une densité de courant relativement élevée dans les systèmes d'ingénierie (jusqu'à 10 A ∙ m-2)23 et possède un réseau complexe de porteurs d'électrons5,22,24,25. Afin de s'adapter à l'évolution du potentiel redox de son accepteur d'électrons, G. sulfurreducens exprime au moins trois voies de transfert d'électrons différentes qui ont chacune une condition de croissance optimale et un signal électrochimique distinct3,5,22,25. Pour ces raisons, G. sulfurreducens est considéré comme un organisme électroactif modèle26.

Les bactéries réductrices de métaux comme G. sulfurreducens peuvent opérer dans une niche relativement limitée en énergie. G. sulfurreducens oxydant l'acétate et réduisant les minéraux de fer naturel (III) peut avoir aussi peu que 0,12 volt de différentiel redox dans le cas de la goethite27, contre environ 1,1 V pour l'oxydation aérobie de l'acétate. Dans les biofilms électroactifs, G. sulfurreducens subit un gradient de potentiel redox puisque les cellules de la région externe du biofilm auront un potentiel effectif inférieur en raison de l'impédance dans la matrice du biofilm28. La capacité de G. sulfurreducens à s'adapter à des conditions redox variables dépend d'un réseau complexe de porteurs d'électrons. Ce métabolisme flexible est strictement dépendant des processus membranaires ; la chaîne de transport d'électrons de la membrane interne de G. sulfurreducens nécessite différentes protéines porteuses d'électrons en fonction de la quantité d'énergie disponible pour la cellule, c'est-à-dire le potentiel redox de l'accepteur d'électrons terminal5,22,29,30. Lorsque l'énergie est limitée par des accepteurs d'électrons à faible potentiel redox, la croissance de G. sulfurreducens pourrait être limitée à la fois par un taux de respiration inférieur selon la cinétique de Nernst et par un rendement inférieur de génération d'ATP par électron respiré. L'effet est un métabolisme respiratoire limité par la membrane. Cette limitation entraîne une diminution de la croissance et du taux respiratoire pour G. sulfurreducens poussant sur des accepteurs d'électrons à faible potentiel redox29,32.

Dans ce travail, nous avons découvert des structures ICM chez G. sulfurreducens. Nous avons utilisé la microscopie confocale, la microscopie électronique à transmission à section mince (TEM) et la tomographie électronique cryogénique (CryoET) pour identifier les structures ICM de G. sulfurreducens qui sont localisées dans des régions subcellulaires spécifiques. En observant les cellules dans différentes conditions redox, nous pouvons tester l'hypothèse selon laquelle l'ICM chez G. sulfurreducens est associée à des conditions thermodynamiques où les cellules doivent respirer à faible potentiel. Ces observations ont des implications importantes pour la compréhension holistique de la respiration dans des conditions d'énergie limitée.

Dans des sections de plastique minces préparées par substitution de congélation de cellules congelées en plongée, nous avons observé des structures ICM dans des cellules de G. sulfurreducens recueillies à partir d'un biofilm qui a été cultivé sur une anode à -0,07 V par rapport à SHE. Les ICM apparaissent principalement sous forme de bandes parallèles de membrane dans le cytoplasme et sont localisés dans une fraction du volume total de la cellule (Fig. 1). Dans certains cas, les ICM ont également été observés sous forme de structures courbes ou circulaires. Dans la plupart des cas, lorsque la section TEM montrait toute la longueur de la cellule, les ICM apparaissaient principalement vers l'une des extrémités de la cellule (Fig. 1b, d). Nous n'avons pas trouvé de cellules avec ICM dans plus d'une zone du cytoplasme, et toutes les cellules de nos coupes en plastique n'avaient pas la preuve de la structure. Nous avons répété la procédure de sectionnement en plastique avec des cellules cultivées à l'aide de fumarate, un accepteur d'électrons soluble avec un potentiel redox plus élevé (E'0 = 0, 03 V vs SHE), et nous n'avons trouvé aucune preuve d'ICM dans les micrographies résultantes (Fig. 1 supplémentaire).

Micrographies TEM incorporées en plastique congelées et substituées par gel de G. sulfurreducens recueillies à partir d'un biofilm d'anode équilibré à -0, 07 V par rapport à SHE. Les structures ICM se présentent sous forme de bandes parallèles dans une zone d'une cellule. a, c et e montrent l'ICM dans des cellules coupées perpendiculairement au grand axe, tandis que b, d et f montrent l'ICM dans des cellules coupées parallèlement au grand axe où l'ICM est situé près de la pointe de la cellule. Les micrographies ont été recueillies sur un FEI TF20. Barres d'échelle : 100 nm.

La MET conventionnelle enrobée de plastique est utilisée pour caractériser les MCI bactériennes depuis plus de 50 ans33. L'ICM de G. sulfurreducens partage certaines caractéristiques morphologiques avec des structures décrites précédemment chez d'autres bactéries. Les bactéries oxydant l'ammoniac (AOB) peuvent produire des ICM avec une membrane continue étroitement pliée en bandes parallèles localisées dans une zone de la cellule, bien que l'ICM dans l'AOB semble occuper une plus grande fraction du volume cellulaire par rapport à ce que nous avons observé dans G. sulfurreducens33. L'ICM dans AOB se forme à partir de l'invagination de la membrane interne33. Dans l'AOB Nitrosomonas eutropha, le développement de l'ICM est stimulé par les conditions d'oxydation de l'ammoniac, mais l'ICM n'est pas développé lors de la dénitrification anoxique34. De même, nous avons observé la production d'ICM chez G. sulfurreducens en réponse à certaines conditions redox environnementales. Chez G. sulfurreducens, nous n'avons pas encore déterminé le mécanisme de signal qui active l'expression de l'ICM ou s'il existe des protéines de type cytosquelettique impliquées dans leur organisation.

En utilisant CryoET de cellules entières, nous avons observé l'ICM sans les artefacts et les dommages membranaires couramment introduits par la déshydratation35. Nous avons cultivé G. sulfurreducens directement attaché sur des grilles TEM, la grille elle-même servant d'anode dans une cellule électrochimique suivie d'une vitrification immédiate. Les reconstructions de cellules de G. sulfurreducens affichent des ICM qui ne sont pas aussi serrées et régulières que ce que nous avons observé avec la section en plastique TEM (Figs. 2, 3). La différence d'apparence de l'ICM entre cryoET et TEM à section mince incorporée dans du plastique pourrait être liée à des artefacts du processus de déshydratation avant l'intégration ou à une différence dans le stade de croissance du biofilm. CryoET a révélé que l'ICM de G. sulfurreducens a une variance significative dans la morphologie. Dans certaines cellules, l'ICM est une masse lâchement organisée de structures membranaires (Fig. 3), mais dans d'autres, il est plus régulier et composé d'unités plus petites (Fig. 2). Cet écart peut représenter différentes étapes de développement de la structure, puisque les échantillons de cryotomographie n'ont été prélevés qu'après 24 h d'introduction d'une grille EM dans la cellule électrochimique, tandis que les images TEM à section plastique capturent des cellules qui ont été collectées à partir d'un biofilm entièrement développé. Les ICM observés dans les cryotomogrammes étaient étroitement associés à la membrane interne dans la plupart des cas, et généralement près de l'extrémité de la cellule (Fig. 2).

a Tranches de tomogramme illustrant comment des modèles 3D ont été créés via la segmentation du tomogramme de l'ICM situé dans la pointe d'une cellule de G. sulfurreducens avec la membrane interne, la membrane externe, l'ICM et plusieurs nanofils modélisés à partir du tomogramme. La barre d'échelle est de 100 nm. b – d Modèles 3D de trois cellules distinctes affichant l'ICM près de la pointe de chaque cellule. Ces cellules ont été cultivées à -0,07 V vs SHE directement sur une grille.

Tranches de cryotomographe et modèle 3D d'une cellule de G. sulfurreducens cultivée à -0, 17 V vs SHE sur une grille cryo-EM trouée en carbone / or comme anode pendant 24 h. Le cryotomogramme montre comment l'ICM semble se former par invagination de la membrane interne. Haut - tranches de tomographie sélectionnées dans l'axe z affichant des sections de l'invagination. Bas - Modèle 3D de la membrane interne et de la membrane externe à travers (en bas à gauche) toute l'épaisseur du volume modélisé et (en bas à droite) le modèle coupé environ en deux sur l'axe z pour montrer le profil ICM à une profondeur différente. Barre d'échelle : 100 nm.

Les nanofils de protéines sont importants pour la respiration de G. sulfurreducens36,37. Nous avons observé des nanofils de protéines extracellulaires dans la plupart des cryotomogrammes que nous avons collectés, mais il n'est pas clair s'il existe une relation directe entre les nanofils et les ICM (Fig. 2, Vidéos supplémentaires 1-5). Certains nanofils croisent la membrane externe près des emplacements de l'ICM, mais d'autres non. Comme l'ICM devrait être une zone d'activité métabolique élevée, l'emplacement des nanofils pour le transfert d'électrons extracellulaires pourrait être préférentiellement localisé près de cette zone.

Dans un échantillon cultivé avec une anode de potentiel inférieur (-0, 17 par rapport à SHE), nous pouvons observer un stade de développement présumé de l'ICM plus précoce (Fig. 3). Il est clairement démontré que l'ICM est formé par invagination de la membrane interne, ce qui est cohérent avec la formation d'ICM chez d'autres bactéries (par exemple, Rhodobacter sphaeroides)38,39. Alors qu'un réseau ICM complexe est évident, une inspection minutieuse montre que toutes les sections sont interconnectées avec l'espace cytoplasmique en leur sein. Il s'agit donc d'une invagination continue de la membrane interne. Plus important encore, l'espace périplasmique est continu, fournissant un chemin vers la membrane externe à partir de toutes les régions de l'ICM. Cet espace périplasmique continu est le plus crucial pour le métabolisme de la respiration extracellulaire de G. sulfurreducens, où les électrons de la membrane interne doivent être transportés de manière extracellulaire, en passant par les cytochromes périplasmiques en cours de route40,41. Il a été prédit que G. sulfurreducens a un périplasme plus large que les autres bactéries en raison de sa plus grande protéine Lpp42. Nous avons mesuré la distance périplasmique de la membrane interne à la membrane externe dans les tomogrammes de cinq cellules différentes de G. sulfurreducens et avons trouvé une distance périplasmique d'environ 40 nm (IC à 95 % [38,4, 40,2], n = 128 mesures, Fig. 2 supplémentaire), qui est supérieure à la distance périplasmique de 30 à 32 nm trouvée chez E. coli dans une autre étude42.

Nous pouvons également identifier la présence d'ICM dans G. sulfurreducens avec la microscopie confocale. Une technique similaire a été utilisée pour identifier l'ICM chez les méthanotrophes43. Nous avons pris des images confocales de cellules de biofilm fixes de G. sulfurreducens cultivées à différents potentiels d'anode ou à partir de suspensions cellulaires cultivées avec du fumarate comme accepteur d'électrons, et chaque image comportait de nombreuses cellules individuelles (tableau supplémentaire 1). L'ICM est une zone lumineuse localisée dans une cellule lorsqu'elle est colorée avec du rouge de Nil, un colorant fluorescent sélectif pour les lipides44. Certaines cellules ont un seul ICM, tandis que d'autres ont plusieurs régions ICM distinctes (Fig. 4b). Généralement, les ICM sont situés près des extrémités des cellules, mais nous avons également observé des ICM à des endroits sur toute la longueur d'une cellule. En utilisant le plugin ImageJ MicrobeJ45, nous pouvons détecter les limites des cellules et les maxima locaux en leur sein que nous avons identifiés comme ICM. La surface ICM en tant que fraction de la surface cellulaire totale avait une valeur médiane de 5,7% dans le biofilm d'électrode cultivé à -0,07 V et 4,2% dans les cellules de fumarate, mais il existe une forte variance dans la surface fractionnaire avec certaines cellules ayant plus de 30% de la surface occupée par l'ICM (Figs supplémentaires 3,4). Ceci est inférieur à la surface cellulaire occupée par les ICM chez les méthanotrophes43. En appliquant une analyse d'image identique (comptage ICM) à des cellules collectées dans différentes conditions, nous avons constaté qu'un changement d'accepteur d'électrons affecte de manière significative la fréquence des cellules de G. sulfurreducens affichant un ICM (Fig. 4a). Dans les biofilms cultivés sur des anodes à des potentiels plus élevés, nous avons observé une fraction relativement plus faible de cellules avec ICM (41 ± 4 % à -0,03 V vs SHE vs 58 ± 8 % à -0,17 V vs SHE). Les cellules cultivées avec du fumarate présentaient la plus faible incidence d'ICM (14 ± 10%) malgré le couple redox fumarate / succinate ayant un potentiel d'environ + 0, 03 par rapport à SHE, similaire en potentiel redox à notre potentiel d'anode le plus élevé étudié. Dans un biofilm, cependant, il y aura un gradient de potentiel redox en raison des pertes ohmiques et des limitations de diffusion23, 46, 47, nous prévoyons donc que les cellules cultivées avec du fumarate connaîtront en moyenne un potentiel redox plus élevé que les cellules de biofilm d'anode sur une électrode à un potentiel similaire. Étant donné que les potentiels d'anode inférieurs fournissent moins d'énergie potentielle pour la croissance25, la plus grande abondance d'ICM peut être une adaptation à la limitation de l'énergie. Notre analyse d'image a utilisé des paramètres conservateurs pour identifier l'ICM dans les cellules, de sorte que la fréquence absolue de l'ICM est probablement plus élevée.

a Fraction de cellules avec un ICM chez G. sulfurreducens dans différentes conditions de croissance. Chaque point représente une image unique avec une moyenne de 113 cellules, voir le tableau supplémentaire 1 pour les chiffres bruts. Les trois potentiels - -0,17, -0,07 et +0,07 - représentent des cellules collectées à partir d'anodes équilibrées aux potentiels respectifs par rapport à SHE. Les cellules en condition «fumarate» ont été cultivées de manière planctonique avec du fumarate comme accepteur d'électrons. Le test statistique consistait en un test t bilatéral avec correction de comparaison multiple de Hochberg. *(ρ < 0,05), ***(ρ ≤ 0,001), ****(ρ ≤ 0,0001). b Projection de la somme des piles z confocales de cellules de G. sulfurreducens cultivées sur une électrode à -0, 07 V par rapport à SHE avec des exemples d'ICM annotés. c Projection de la somme des cellules cultivées avec du fumarate en tant qu'accepteur d'électrons illustrant la morphologie cellulaire typique en l'absence d'ICM. Les deux images cellulaires ont été recadrées à partir d'images plus grandes prises à un grossissement de 100X en utilisant du rouge de Nil comme fluorophore sélectif des phospholipides. Voir les encarts agrandis dans la Fig. 5 supplémentaire.

G. sulfurreducens a un métabolisme respiratoire complexe et efficace. Au niveau de la membrane interne, les électrons sont trifurqués dans différentes voies respiratoires en fonction du potentiel redox de l'accepteur d'électrons terminal3,5,22. Étant une invagination de la membrane interne, l'ICM doit contenir les cytochromes critiques de la membrane interne pour la respiration. Chez les bactéries oxydant l'ammoniac et le méthane, les enzymes respiratoires limitantes - l'ammoniac monooxygénase et la méthane monooxygénase, respectivement - sont présentes dans l'ICM15,17. Pour les organismes avec des marges thermodynamiques minces, un ICM pourrait permettre un taux de respiration plus élevé en augmentant la surface de la membrane et le nombre total de protéines respiratoires. La production d'un ICM doit être un investissement énergétique important pour une cellule, et l'organisation structurelle de l'ICM chez G. sulfurreducens suggère une fonction spécialisée en dehors du stockage des lipides. La production d'ICM explique pourquoi G. sulfurreducens a une teneur en lipides plus élevée que les autres bactéries Gram-négatives48, car la production d'ICM dans d'autres bactéries entraîne des fractions lipidiques élevées43,49.

Dans notre étude, nous avons trouvé une incidence plus élevée d'ICM dans les cellules en croissance dans des conditions moins favorables sur le plan thermodynamique (Fig. 4a), ce qui est cohérent avec l'utilisation d'un ICM pour augmenter les fréquences respiratoires dans des conditions limitantes. Un ICM respiratoire chez G. sulfurreducens nécessiterait un mécanisme pour transmettre les électrons au reste du réseau de transfert d'électrons extracellulaire, et s'il existe une connexion ouverte avec le périplasme, comme le montre la figure 3, les électrons pourraient être transférés par diffusion de cytochromes périplasmiques (par exemple, PpcA, GSU1996)40,50. Pourtant, le transport de ces cytochromes des ICM vers la membrane externe serait une distance beaucoup plus grande que l'espace périplasmique typique, puisque les ICM semblent couvrir toute l'épaisseur de la cellule et avoir des régions qui sont jusqu'à 200 nm de la membrane externe.

Alors que G. sulfurreducens n'est pas la seule bactérie avec un ICM, rien de tel que l'ICM n'a été trouvé dans des organismes étroitement apparentés. À notre connaissance, il s'agit du premier organisme du phylum Thermodesulfobacteriota identifié pour produire un ICM, le premier réducteur d'oxyde métallique qui le fait et la première documentation d'ICM formés dans des biofilms. L'ICM dans G. sulfurreducens offre une bonne occasion d'étudier la formation d'ICM en général, car nous pouvons facilement contrôler son expression en modifiant le potentiel redox de l'accepteur d'électrons, et la localisation polaire de l'ICM dans la pointe présente une opportunité d'étudier l'organisation intracellulaire chez les bactéries. La production variable d'ICM chez G. sulfurreducens suggère que cette structure se forme naturellement pour augmenter les fréquences respiratoires dans des conditions thermodynamiquement et cinétiquement limitantes, une hypothèse qui a déjà été proposée pour d'autres micro-organismes8. Contrairement à d'autres bactéries qui produisent des ICM, G. sulfurreducens ne peut pas terminer l'intégralité de sa voie respiratoire au sein de l'ICM. Les électrons de l'ICM dans G. sulfurreducens doivent se rendre à la membrane externe pour la respiration extracellulaire, et ces électrons peuvent devoir parcourir des microns à travers un biofilm avant d'atteindre l'accepteur d'électrons terminal

G. sulfurreducens a diverses approches pour optimiser la conservation de l'énergie dans des conditions redox limitantes et variables. Trois voies caractérisées semblent s'exprimer de manière concomitante au sein d'un biofilm électrogénique pour maximiser la conservation de l'énergie51. La génération d'ICM dans des conditions de limitation d'énergie semble être un outil supplémentaire pour maximiser la production d'énergie au sein de la cellule. Les modèles nernstiens utilisés pour prédire les taux de respiration chez G. sulfurreducens prédiraient un taux de respiration lent à des potentiels inférieurs28,31,52 Le taux de respiration plus lent est la conséquence d'une protéine de transfert d'électrons limitant le taux, proposée pour être au niveau de la membrane interne28,53. Si G. sulfurreducens peut augmenter la quantité de cette protéine limitant la vitesse en augmentant la quantité de membrane interne présente, la limitation apparente est atténuée et des fréquences respiratoires plus élevées peuvent être atteintes. Ainsi, la connaissance de la façon dont les ICM sont utilisés et dans quelles conditions ils sont produits sera importante pour prédire les taux de génération de courant électrique par G. sulfurreducens. Les futures études ICM sur G. sulfurreducens tireront probablement parti des outils génétiques qui ont été développés pour l'organisme ainsi que des techniques d'imagerie créatives.

G. sulfurreducens PCA (ATCC, Virginia USA) a été cultivé à partir de stocks de congélateur de glycérol en utilisant du fumarate ou une électrode comme accepteur d'électrons25. Les cellules de fumarate ont été cultivées dans des tubes de culture anaérobie scellés avec un milieu ATCC 1957 contenant 1,5 g de NH4Cl, 0,6 g de NaH2PO4, 0,1 g de KCl, 2,5 g de NaHCO3, 0,82 g d'acétate de sodium, 8 g de fumarate de sodium et 10 ml de chacune des solutions minérales de Wolfe et de Wolfe par litre d'eau qui a été barbotée avec du gaz avant scellage et autoclavage. Un mélange gazeux de 80/20% N2/CO2 a été utilisé dans toutes les conditions pour éliminer l'oxygène du milieu et maintenir un pH proche de 7. Les cellules d'électrode ont été cultivées en utilisant le même milieu sans fumarate dans des cellules électrochimiques microbiennes à chambre unique de 100 ml sur des électrodes en graphite de 6 à 8 cm2 (Graphitestore, Illinois USA) équilibrées à -0,17, -0,07 ou +0,07 V par rapport à SHE. Le courant électrique a été surveillé avec un potentiostat VMP3 (BioLogic, Tennessee USA). Les flacons du réacteur ont été remplis de milieu, autoclavés à 121°C, puis mis à barboter avec du gaz pour éliminer l'oxygène avant l'inoculation. Chaque réacteur avait une électrode de référence Ag/AgCl (BASi, Indiana USA).

Les cellules de G. sulfurreducens d'un biofilm mature (~ 30 jours de croissance) ont été fixées dans un tampon phosphate contenant 4 % de paraformaldéhyde, 2 % de glutaraldéhyde (v/v), puis plongées congelées dans du propane liquide avant déshydratation par substitution de congélation dans 2 % de tétroxyde d'osmium dissous dans de l'acétone sur de la neige carbonique à -80 °C. Les cellules ont été lentement ramenées à température ambiante pour être enrobées dans de la résine Araldite 502 (Ted Pella, Inc.). Ces sections ont été coupées à 70 nm d'épaisseur et colorées secondairement avec de l'acétate de plomb pour améliorer le contraste. Toutes les coupes minces ont été réalisées sur un Tecnai TF-20 (FEI) ou un Phillips CM12.

Pour développer des cellules de biofilm d'électrodes pour cryoET, nous avons conçu un support pour les grilles TEM en carbone fenestré à insérer dans des cellules bioélectrochimiques avec des cultures en croissance active. Les grilles du support sont maintenues contre une plaque de titane qui sert d'anode et d'accepteur d'électrons pour les bactéries. Des repères de nanoparticules d'or conjugués à la BSA de 6 nm ont été séchés puis cuits à 60 ° C pour fixer les repères d'or sur les grilles avant introduction dans le bioréacteur. Les grilles TEM dans le support ont été retirées après 24 h et immédiatement congelées par plongée dans de l'éthane refroidi à l'azote liquide à l'aide d'un congélateur à plongée manuel conçu en interne pour capturer les cellules dans leur état actif (Figs. 6, 7 supplémentaires). Pour la condition fumarate, une suspension de cellules cultivées pendant 7 à 10 jours a été pipetée sur chaque grille, buvardée pour éliminer l'excès de liquide et congelée avec le FEI Vitrobot Mark IV.

Les cellules hydratées congelées ont été imagées sur un Krios G2 (FEI, Oregon USA) à des inclinaisons de -65° à +65˚ par pas angulaires de 2,0˚ en utilisant un schéma de collecte à symétrie de dose54 dans des régions où des cellules individuelles pouvaient être observées sur des fenestrations dans le carbone. Les images ont été collectées à un grossissement nominal de 6500x donnant une taille de pixel de 1,8 Å en mode super-résolution sur la caméra du sommet K2 avec un débit de dose de 0,5 électron par Å2 * seconde pendant trois secondes avec une fréquence d'images de 0,2 images par seconde (dose totale de 100 électrons par Å2). Les images vidéo individuelles ont été corrigées en gain, alignées avec MotionCor255, et les images de somme ont été regroupées par 2, ce qui a donné une image avec une échelle de 3,6 Å/pixel. Les images sommées ont été réempilées, puis une reconstruction tomographique dans eTOMO56 a été effectuée. Des tranches de chaque tomogramme ont été produites à partir d'IMOD à l'aide de la fonction d'économie de fenêtre ZAP, qui enregistre à la résolution native du moniteur. La modélisation 3D a été réalisée dans IMOD et visualisée dans ChimeraX57.

Les cellules de biofilm d'anode de G. sulfurreducens ont été remises en suspension, fixées et imagées entre 12 et 20 jours après que le courant a commencé à croître de façon exponentielle et était d'au moins 2 A/m2. Les cellules de biofilm de G. sulfurreducens ont été retirées de l'électrode par vortexage doux dans un tampon phosphate, culottées à 4000 xg pendant 5 min, remises en suspension dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 1 h, puis rincées et stockées dans un tampon phosphate à 7 ˚C. Des cellules vivantes de G. sulfurreducens cultivées dans des conditions de fumarate ont été imagées 5 à 7 jours après l'inoculation. Les cellules dans des conditions d'anode et de fumarate ont été diluées avec un tampon phosphate 50 mM pour la coloration des lipides avec du rouge de Nil (ThermoFisher/Invitrogen, rouge, excitation : 561 nm) jusqu'à une concentration finale de 2 µg/mL. Les échantillons ont été laissés à incuber pendant au moins 15 min à température ambiante dans l'obscurité. Les cellules colorées ont été imagées sur une lame de verre standard ou une lame de verre enduite de poly-L-lysine à 2% avec une lamelle de 1 ½ scellée avec du vernis à ongles.

Les images de fluorescence ont été acquises avec un microscope confocal Nikon C2 + équipé d'un objectif à huile 100X Plan Apo λ (NA 1,45) à l'aide du logiciel NIS Elements adjacent, fonctionnant à l'intérieur d'une boîte à gants anaérobie. Le rouge de Nil a été excité avec un laser à 561 nm et filtré avec un cube filtre 525/50 561 LP.

Les piles Z ont été transformées en projections de somme et un filtre de flou gaussien (σ = 1) appliqué pour le lissage dans ImageJ. Le plug-in ImageJ MicrobeJ45 a été utilisé pour la détection bactérienne et ICM des cellules de G. sulfurreducens dans des conditions d'anode et de fumarate avec une sortie récapitulative dans le tableau supplémentaire 1 et des paramètres d'analyse dans la Fig.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les tomogrammes utilisés pour créer des figures pour ce manuscrit sont accessibles dans le référentiel EMDB-EBI sous les numéros d'accession EMD-27710, EMD-27729, EMD-27748 et EMD-27747.

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Le financement de ce travail a été fourni par l'Office of Naval Research (prix ONR N0014-20-1-2269). La microscopie confocale a été réalisée dans un Nikon C2 + obtenu grâce à une subvention ONR DURIP N00014-19-1-2531. Toute la microscopie électronique a été réalisée dans les installations centrales de microscopie électronique de l'ASU. La manipulation du modèle 3D a été partiellement réalisée avec UCSF ChimeraX, développé par la Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics de l'Université de Californie à San Francisco, avec le soutien des National Institutes of Health R01-GM129325 et de l'Office of Cyber ​​Infrastructure and Computational Biology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.

École d'ingénierie durable et de l'environnement bâti, Arizona State University, Tempe, AZ, États-Unis

Ethan Howley

École d'ingénierie des transports de masse et de l'énergie, Arizona State University, Tempe, AZ, États-Unis

Anna Mangus et Caesar I. Tours

Eyring Materials Center, Arizona State University, Tempe, Arizona, États-Unis

Dewight Williams

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EH a planifié et réalisé des expériences, créé des figures, rédigé la première ébauche du manuscrit et édité le manuscrit; AM a planifié et réalisé la microscopie confocale ; DW a effectué une cryotomographie ; CT a obtenu un financement, planifié l'étude et édité le manuscrit.

Correspondance à César I. Torres.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Howley, E., Mangus, A., Williams, D. et al. Les membranes intracytoplasmiques se développent chez Geobacter sulfurreducens dans des conditions thermodynamiquement limitantes. npj Biofilms Microbiomes 9, 18 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00384-6

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Reçu : 05 octobre 2022

Accepté : 17 mars 2023

Publié: 07 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41522-023-00384-6

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